新麦草基因组重复序列组成及在赖草属物种染色体上的分布

Composition of the Genome Repeat Sequences of Psathyrostachys juncea and Its Distribution on the Chromosomes in Leymus Species

摘要

新麦草（Psathyrostachys juncea）被认为是赖草属植物的一个重要祖先物种。对新麦草中高度重复序列Cot-1 DNA文库克隆测序分析鉴定，结果表明新麦草Cot-1 DNA文库中的序列可以分为6种类型：反转座子、转座子、卫星DNA、抗病相关LZ-NBS-LRR、未能鉴定类型、反转座子LTR和LTR/Copia类型序列组合型，占比分别为49.5%、1.0%、28.7%、5.9%、13.9%和1.0%。进一步利用2种卫星DNA序列和5个反转座子序列为探针，对新麦草、赖草（Leymus secalinus）和2个大赖草（L. racemosus）材料进行染色体荧光原位杂交，结果表明卫星DNA序列TaiI-family和pSc250-family杂交信号主要分布在染色体的端部，TaiI-family杂交信号数量分别为20、16、7和18，而卫星DNA序列pSc250-family在新麦草、赖草中的杂交信号数量分别为17和24，在2个大赖草材料均没有信号检出。反转座子序列在3个物种染色体上基本呈散布分布方式，而且在赖草属物种染色体分布呈现同质化倾向，其中克隆序列pPj-44和pPj-28在新麦草和赖草属物种间信号分布差异显著，分别提示在异源多倍化过程中存在序列扩张和收缩，克隆序列pPj-77仅在1个大赖草材料10个染色体杂交信号强度区别于其余染色体。研究结果表明，新麦草重复序列在赖草多倍体形成过程发生了快速进化并可能存在同质化扩散，同时赖草属不同物种基因组间重复序列组成可能存在显著差异。

Abstract

Psathyrostachys juncea was considered an important ancestral species of Leymus. The genomic Cot-1 DNA library with highly repeat sequences of Psa. juncea was constructed， and sequenced and characterized， and the results showed that the library could be classified into six types： retrotransposons， transposons， satellite DNA， LZ-NBS-LRR， uncharacterized sequences， and retrotransposon LTR mixed LTR/Copia， and the proportions were 49.5%， 1.0%， 28.7%， 5.9%， 13.9% and 1.0% of the Cot-1 DNA， respectively. Furthermore， two satellite DNAs and five retrotransposon sequences were used as probes， and chromosomes in Psa. juncea， Leymus secalinus and L. racemosus were detected by florescence in situ hybridization （FISH）. The results showed that the hybridization signals of satellite DNA sequences TaiI-family and pSc250-family were mainly distributed at the ends of chromosomes， and the number of TaiI-family hybridization signals were 20， 16， 7， and 18 in Psa. juncea， L. secalinus， L. racemosus （PI 531811） and L. racemosus （PI 531812）， respectively， and the number of pSc250-family hybridization signals were 17 and 24 in Psa. juncea and L. secalinus， respectively， but no signal was detected in two L. racemosus samples. The distribution of retrotransposon sequences on the chromosomes of three detected species was basically dispersed， and the distribution of chromosome sequences in Leymus species showed a tendency of homogenity. Especially， clone sequences pPj-44 and pPj-28 showed significant differences in signal distribution between Psa. juncea and Leymus species， suggesting sequence expansion and contraction， respectively， during allopolyploidization， and clone sequence pPj-77 only differentiated the hybridization intensity of 10 chromosomes from the rest of the chromosomes in one L. racemosus（PI 531812）. The results suggested the repeats of Psa. juncea evolved rapidly and had homogenous diffusion during the polypoid formation of Leymus species and the repeat composition might be significant different among different Leymus species.

Graphical abstract

关键词

新麦草 / 赖草 / 重复序列 / 染色体荧光原位杂交 / 多倍化

Key words

Psathyrostachys juncea / Leymus / repetitive sequences / fluorescence in situ hybridization / polyploid

新麦草属（Psathyrostachys）是禾本科（Poaceae）小麦族（Triticeae）中较小的一个属，全世界约 8种^［1］，主要分布于欧亚地区的草原及半荒漠地区，在我国的自然分布区位于天山、阿尔泰山和青藏高原等地。据遗传学家Dewey确认，新麦草（Psa. juncea）为二倍体物种，其染色体数2n＝14，染色体组型为NN^［2］。新麦草为多年生密丛型下繁禾草，是优良的放牧型禾草，同时也是麦类作物改良的优异种质资源^［3］。

赖草属（Leymus）是禾本科（Poaceae）小麦族（Triticeae）一个重要多年生属，包含30~60个种，主要分布于欧亚大陆和北美的温带地区。赖草属物种起源于异源多倍体，包含2个基本的基因组Ns和Xm^［4］，形态学、细胞学、DNA分子杂交及DNA序列证据表明Ns来自新麦草属植物^［4-7］，但是Xm基因组的来源存在争议。利用寡拷贝基因序列系统学分析证据，新麦草被认为是与赖草属Ns基因组亲缘关系最为接近的新麦草属物种^［8-9］。

重复序列是真核生物基因组的主要部分，约占70%以上^［10］，而小麦族物种中重复序列成分占整个基因组的80%以上^［11］。重复序列进化迅速，可以用来鉴定近缘物种基因组间的遗传分化^［12-13］。利用重复序列作为探针，进行DNA分子杂交和染色体荧光原位杂交分析，结果支持赖草属基因组中Xm基因组依然来自新麦草，建议赖草属基因组组成为Ns₁Ns₂^［6，14］。来自单拷贝基因的结果认为，Xm基因组起源不同于Ns物种^［8-9］。Anamthawat-Jónsson^［14］认为在赖草属植物Ns和Xm基因组物种形成异源多倍体初期，可能存在Ns基因组特异性散在重复序列向整个基因组快速扩散并成主导成分，使得整个核基因组同质化。

植物Cot-1 DNA富集了基因组中高度和重度重复序列成分^［15-16］，通过Cot-1 DNA克隆文库的测序分析，可以发现基因组中的大量重复序列，并可以通过染色体荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）鉴定重复序列在染色体的物理分布^［17］。本研究通过构建新麦草基因组Cot-1 DNA文库，分析鉴定克隆序列，解析新麦草基因组重复序列成分组成，并在此基础上利用FISH技术揭示这些重复序列在赖草物种基因组中的分布，探索赖草属物种基因组组成以及多倍化形成中重复序列的进化特性。

1 材料与方法

1.1　材料

材料包括1个新麦草属物种和2个赖草属物种。赖草（L. secalinus）种子采集于青海省西宁市西北高原生物研究所试验地，大赖草2个材料由美国国家植物种质资源库提供。供试材料的名称、染色体组组成、倍性、编号和来源见表1。

1.2　方法

1.2.1　Cot-1 DNA制备及文库构建

Cot-1 DNA制备主要参照Zwick等^［16］的方法，利用5 mol·L^-1 NaCl溶液和ddH₂O将提取的基因组DNA稀释至300 ng·μL^-1，NaCl终浓度为0.3 mol·L^-1。稀释好的基因组DNA在高压灭菌锅中打断在100~1 000 bp。打断后的DNA于沸水水浴10 min，立即置冰上2 min，65 ℃水浴复性，参考Zwick等^[16]方法计算DNA复性时间。利用S1核酸酶3在37 ℃下水浴消解8 min，纯化后可得Cot-1 DNA。

Cot-1 DNA文库构建具体操作步骤如下：将末端加“A”的Cot-1 DNA与pGEM-T easy载体连接，将连接产物转化入E.coli DH5α菌株，将菌体涂布在添加Amp、IPTG、X-gal的LB蓝白斑筛选培养基上筛选单菌落阳性克隆，利用M13引物扩增后将产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.2.2　荧光原位杂交探针制备

挑选Cot-1 DNA文库中部分代表性序列为探针DNA模板（见表2~3），利用随机引物法，采用Tetramethyl-rhodamine-5-dUTP（Roche Diagnostics）进行标记。

1.2.3　染色体制片和荧光原位杂交

根尖染色体的制片和染色体荧光原位杂交程序，以及观察照相等参照路兴旺等^［18］的方法。

2 结果与分析

2.1　新麦草重复序列组成分析

从新麦草Cot-1 DNA文库中随机挑选120个克隆，其中测序成功的有101个，插入片段的大小为15~309 bp，主要在60 bp以上。根据序列组装以及与NCBI的GenBank数据库和REPBASE（http：//www.girinst.org/censor/index.php）数据库核酸序列同源比对的结果，可将101个克隆序列分为6个类别：反转座子（retrotransposons）类型、转座子（transposons）类型、卫星DNA类型、抗病相关LZ-NBS-LRR类型、uncharacterized sequences类型、由LTR类型序列和LTR/Copia类型序列组合起来的反转座子长末端重复序列LTR+LTR/Copia类型。在这6个类别中，反转座子类型（50个克隆）在新麦草Cot-1文库中的比例最大（49.5%）；其次是卫星DNA序列类型，占比28.7%（29个克隆）；uncharacterized sequences类型占比13.9%（14个克隆）；LZ-NBS-LRR类型（6个克隆）占比5.9%；转座子类型（1个克隆）以及LTR+LTR/Copia（1个克隆）分别占比1.0%。

新麦草Cot-1 DNA文库中卫星DNA序列有 3种类型：TaiI-family类型、pSc250-family类型和N8-family类型。TaiI-family类型（16个克隆）为Cot-1 DNA文库中占比最大的卫星DNA，所占比例为14.9%；其次是pSc250类型（12个克隆）的序列，所占Cot-1 DNA文库比例为11.9%；N8-family类型（1个克隆）仅占Cot-1 DNA文库的1.0%。

进一步对Cot-1 DNA文库中占比最大的反转座子序列进行鉴定分型，比对核酸序列可得到LTR类型、LTR/Gypsy类型、LTR/Copia类型和LTR+Afa-family类型4个类型的重复序列。在所有含LTR的长末端重复序列中，LTR类型（21个克隆）占比最大，其在总的Cot-1 DNA文库中占比为20.8%；LTR/Gypsy类型（19个克隆）占比为18.8%；LTR/Copia类型（10个克隆）占比为9.9%。

2.2　卫星DNA序列在新麦草及赖草物种中染色体分布

用克隆pPj-2和pPj-76分别代表TaiI-family以及pSc250重复序列类型，对上述载体序列进行荧光探针标记（见表2~3），对这些序列在有丝分裂中期染色体的分布特征进行检测。结果表明，pPj-2和pPj-76探针基本都在新麦草和赖草染色体端部呈现强烈的杂交信号，新麦草TaiI-family和pSc250-faimily序列类型在小麦族其他物种中的染色体分布特征呈现高度保守性^［19-20］。本研究中用到的1个新麦草材料和2个大赖草材料与Wang等^［21］研究中所用材料均为共同来源材料（具有相同ID），pLrTaiI和本研究中赖草的TaiI序列探针在这3个材料染色体上的分布方式高度一致。pPj-2探针（TaiI-family）在新麦草、赖草、大赖草（PI 531811）和大赖草（PI 531812）杂交信号数量分别为20、16、7和18。pPj-76探针（pSc250-faimily）在新麦草和赖草杂交信号数量分别为17和24，但是在2个大赖草材料均没有信号检出。

2.3　反转座子序列在新麦草及赖草物种中染色体分布

对2个长末端反转座子重复序列（LTR）和3个长末端反转座子LTR-Gypsy序列进行探针标记，对新麦草、赖草以及大赖草进行染色体涂染杂交，结果表明5个重复序列在不同序列之间、同一序列在不同物种以及同一物种不同材料间FISH杂交信号具有多态性（图1~2）。LTR-Gypsy探针pPj-44在新麦草染色体上没有明显杂交信号检出，在赖草和大赖草染色体上呈现相似的分布，主要分布于染色体着丝粒、近着丝粒聚集间质区，少量染色体端部有分布，同时在不同染色体上信号强度分布不均一（图1：a1~d1）。LTR-Gypsy探针pPj-55在新麦草染色体上主要分布于染色体间质区，在赖草和大赖草染色体上的分布方式与新麦草相似，但是在赖草中的杂交信号强度明显强于在大赖草中的信号强度（图1：a2~d2）。

LTR-Gypsy探针pPj-77在新麦草大多数染色体上呈现强烈杂交信号，信号主要分布于近着丝粒及间质区，在1个染色体上没有信号分布，在赖草每个染色体上均有分布，但是信号强度弱于在新麦草染色体上的信号强度，在赖草染色体上的信号分布方式与赖草相似，但是在材料PI 531811，少量染色体上信号强度略强于其他染色体，在材料PI 531812中约在12条染色体上有信号分布，强度显著强于其他染色体（图2：a3~d3）。LTR探针pPj-28在新麦草中的杂交信号强度强，且分布于染色体的每一个区域，但是在赖草和大赖草物种中基本分布于近着丝粒区和间质区，并且杂交信号强度为赖草高于大赖草，大赖草材料PI 531812高于材料PI 531811（图2：a4~d4）。LTR探针pPj-85在新麦草所有染色体具有强烈的分布，在赖草染色体上具有弱的分布，并且不同染色体间信号强度分布也存在差异，在大赖草染色体上分布信号强度强于在赖草中的分布，同时大赖草材料PI 531811中的信号分布数量显著少于材料PI 531812（图2：a5~d5）。

3 讨论

卫星DNA重复序列家族TaiI被认为是在新麦草和赖草属植物中普遍存在的一类串联重复序列，而且其分布丰度在不同物种及同一物种不同材料间具有差异性^［21］。本研究所用1个新麦草材料和2个大赖草材料与Wang等^［21］所用材料相同，利用新麦草TaiI序列检测得到的信号位点数与用大赖草TaiI序列所检测到的信号位点数高度一致。但是所用的赖草材料来源不同，Wang等^［21］在赖草中检测到TaiI家族序列杂交位点为2~9个，而在本研究所用材料中检测到的杂交位点数为16个，这进一步说明TaiI家族序列丰度在种间及种内的高度变异性。pSc250首先在小麦族物种黑麦（Secale cereale）中克隆，而后在小麦族多个物种中被发现的一类卫星重复序列^［20］。本研究揭示在新麦草基因组中该序列的存在，并且在新麦草和赖草染色体杂交信号丰富，但是在大赖草染色体上没有信号检出，表明该序列在不同物种间的高度变异特性。在高等植物中，一些种属特异性卫星DNA家族具有快速变异特性，为基因组中一类快速进化的成分^［13］。虽然新麦草被认为是赖草属物种Ns基因组的祖先供体^［8-9］，但是由于新麦草和赖草属物种中卫星DNA的这种快速进化特性，很难通过祖先种染色体的卫星DNA序列分布特性在异源多倍体物种中对这些染色体进行识别。另外，种间和种内变异特性提示卫星DNA序列进化可能在新麦草属和赖草属植物种间分化以及种内适应性分化中起着重要作用。

在小麦族物种中转座因子重复序列成分占整个基因组的80%以上^［11］，基因组特异性转座因子序列可以作为探针用来识别异源多倍体物种中的祖先染色体^［22］。在本研究中，利用新麦草Cot-1 DNA中克隆得到的5个反转座子序列探针对赖草属2个物种进行染色体涂染，其中只有1个序列探针（pPj-77）能将1个大赖草材料中的12个染色体根据信号强度和其他染色体进行显著区分，但是在赖草和另外一个大赖草材料中这种区分并不明显。另外，序列探针pPj-55在新麦草中没有明显杂交信号，但是在赖草属物种中均有信号检出，表明此序列在多倍体形成过程中得到了显著的扩张；序列探针pPj-28在新麦草中的信号分布强度及染色体分布范围均显著高于在赖草属物种染色体上的分布，表明此序列在赖草属多倍体形成过程得到了显著收缩。Anamthawat-Jónsson基于细胞遗传学研究结果提出，在赖草属植物Ns和Xm基因组物种形成异源多倍体初期，可能存在Ns特异性散在重复序列向整个基因组快速扩散并成主导成分，使得整个核基因组同质化^［14］。本研究中， 5种散在重复序列在赖草属物种染色体上的分布方式在大多数染色体上呈现相似性，研究结果支持赖草属物种多倍化过程中可能存在重复序列的同质化扩散，同时提示在这种扩散过程中伴随新麦草本身基因组中重复序列的扩张或收缩。赖草属物种多倍化过程中重复序列的同质化扩散，在某种程度也能解释利用重复序列作为探针进行染色体原位杂交和基因组DNA杂交支持赖草属物种基因组为Ns₁Ns₂^［6，14］，而用单拷贝基因支持赖草属基因组组成为Ns和另外一个未能确定的基因组Xm^{［8-9，23］}。

本研究中无论利用串联重复序列探针还是散在重复序列，都能揭示赖草属不同物种以及同一物种不同来源材料间存在染色体杂交信号的差异性。对大赖草和滨麦（Leymus mollis）基因组DNA分别用不同的标记方法，在他们的F₁杂种进行FISH杂交时，来自2个亲本的染色体可以被涂染成显著不同的颜色，但是来自不同亲本物种的减数分裂配对正常^［24］，表明虽然大赖草和滨麦具有相同的NsXm基因组，但是二者基因组中散在重复序列组成显著不同。基于叶绿体和单拷贝核基因系统学分析，Zhou等^［23］认为赖草属物种具有多起源及网状进化特征。结合本研究结果，认为虽然赖草属物种具有共同的基因组组成，但是不同物种或不同材料间基因组在重复序列的组成上可能存在显著差异，这种差异可能由物种形成过程中的不同途径和环境选择压力所塑造。

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基金资助

青海省自然科学基金（团队项目）(2022-ZJ-902)