远缘杂种牡丹分生结节诱导及不定芽分化

Meristematic Nodule Induction and Adventitious Shoot Differentiation in Distant Hybrid Tree Peony

摘要

该研究以亚组间和组间远缘杂种牡丹的叶柄为外植体，探索一种操作简便、适用于多个品种的分生结节诱导方法，并在部分品种中研究分生结节分化不定芽的条件。结果表明：将11个品种的叶柄薄层接入含有0.5 mg·L^-1萘乙酸（NAA）+1.0 mg·L^-1氯吡脲（CPPU）+0.5（或0） mg·L^-1噻苯隆（TDZ）的SH培养基中，在黑暗条件下培养60~100 d，可以在10个品种中一步诱导出分生结节，诱导率达到52.08%~83.33%；一步法诱导的分生结节是通过愈伤组织间接产生。将分生结节接入含有0.5（或1） mg·L^-1 CPPU+0.5 mg·L^-1 TDZ的改良WPM培养基中，在光照、每15 d继代一次的条件下，可以诱导3个品种的不定芽分化，分化率为6.67%~33.33%；较低浓度的CPPU和TDZ共同使用对于不定芽分化有促进作用，而单独使用高浓度的CPPU不利于不定芽分化。该研究筛选出了一步法诱导分生结节的通用培养基，并在部分品种中实现了不定芽分化，为建立远缘杂种牡丹植株再生体系提供了重要参考。

Abstract

To explore a simple and suitable method for inducing meristematic nodules in multiple cultivars， the petioles of inter-subsectional and inter-sectional distant hybrid tree peony were used as explants， and the conditions for the differentiation of meristematic nodules into adventitious shoot in some cultivars were also identified. The results showed that meristematic nodules were induced by one step in 10 cultivars with 52.08%- 83.33% induction rates， the thin layers of petioles of 11 cultivars were continuously cultured on SH medium containing 0.5 mg·L^-1 NAA+1.0 mg·L^-1 CPPU+0.5（or 0） mg·L^-1 TDZ for 60-100 d in the dark， and meristematic nodules induced by one step were generated indirectly from the callus. Adventitious shoot differentiation rate of three cultivars was 6.67%-33.33% when meristem nodules were added to the modified WPM medium containing 0.5（or 1） mg·L^-1 CPPU+0.5 mg·L^-1 TDZ under light condition and sub-cultured every 15 days. Lower concentrations of CPPU and TDZ together promoted adventitious shoot differentiation， but high concentrations of CPPU alone were not conductive to adventitious shoot differentiation. The general medium for one-step induction of meristematic nodules was screened， and adventitious shoot differentiation was achieved in some cultivars， which provided an important reference for the establishment of plant regeneration system for distant hybrid tree peonies.

Graphical abstract

关键词

亚组间杂种牡丹 / 组间杂种 / 分生结节 / 不定芽

Key words

Paeonia × lemoinei / intersectional hybrids of Paeonia / meristematic nodule / adventitious shoot

牡丹（Paeonia suffruticosa）是芍药科（Paeoniaceae）芍药属（Paeonia）的落叶灌木，具有重要的观赏、药用和油用价值^［1］。育种周期长、繁殖系数低，是限制牡丹新品种培育和推广的主要瓶颈^［2］。植株再生体系的建立和优化是提高植物繁殖和育种效率的有效途径^［3-4］，也是近年来牡丹研究的重要方向之一。植株再生主要有体细胞胚发生和器官发生两种途径，这两种途径都可能由外植体直接或通过愈伤组织间接实现植株再生^［5-7］。与愈伤组织不同，分生结节是一种具有表皮和维管组织中心，具备较高增殖与分化潜力的结构^［8］。基于分生结节的植株再生已经在多种植物中获得成功，表明这是一种可靠且高效的植株再生途径^［8-11］。

分生结节的诱导与植株再生已在牡丹中取得一定进展。目前，在紫斑牡丹（P. rockii）^［12］、‘凤丹’（P. ostii ‘Feng Dan’）^［13］、亚组间杂种牡丹（P. × lemoinei）、牡丹与芍药的组间杂种^［14］中实现了分生结节的诱导。但现有的牡丹分生结节诱导步骤多、时间长，诱导培养基在不同种类或品种之间存在较大差异，亟需探索一套更加简便、适用材料较广的分生结节诱导技术。牡丹分生结节诱导器官分化与再生植株的技术也还不成熟，分化效果受基因型影响较大，目前，仅在‘凤丹’中实现了植株再生^［13］，在亚组间杂种牡丹‘Golden Era’中实现了不定芽分化^［14］。此外，成功诱导牡丹分生结节的外植体包括成体植株的叶片、叶柄^{［12，14］}和种胚的子叶^［13］，但目前仅实现了以子叶作为外植体时的植株再生。因此，牡丹分生结节诱导器官分化的条件还需优化，以突破基因型、外植体等因素的限制，并提升分化效率。

亚组间和组间远缘杂交是现代牡丹育种的重要方向，已培育出许多花色新颖、花期长、适应性强、广受市场欢迎的牡丹新品种^［2，15］。本研究选用8个亚组间杂种牡丹和3个组间杂种的叶柄作为外植体，采用一步法诱导分生结节，并筛选通用性较强的分生结节诱导培养基；在此基础上对3个亚组间杂种进行分生结节分化研究，探索这些品种分生结节的不定芽分化条件。旨在建立一套以成体营养器官为外植体、操作简便且通用性较好的分生结节诱导方法，为实现远缘杂种牡丹的不定芽分化与植株再生提供参考。

1 材料与方法

1.1　植物材料

研究选用的11个远缘杂种牡丹材料包括8个亚组间杂种（P.× lemoinei）：‘Golden Isles’（‘金岛’，GI）、‘Renown’、‘High Noon’（‘正午’，HN）、‘07-LB-19’、‘Oukan’（‘黄冠’）、‘Golden Era’（GE）、‘Alice Harding’（‘金晃’，AH）、‘Souvenir de Maxime Cornu’（‘金阁’，SMC）；3个组间杂种：‘Lemon Dream’（LD）、‘Bartzella’、‘京华幻彩’。所有材料均栽植于北京林业大学鹫峰实验林场。

1.2　分生结节诱导

4月下旬剪取植株展叶期或风铃期的叶柄放入玻璃瓶中，流水浸泡20 min，然后加入洗洁精流水冲洗20 min。冲洗完毕后放入超净工作台消毒，用75%乙醇浸泡30 s~1 min，5%的次氯酸钠浸泡10 min，无菌蒸馏水冲洗3~5次。

将消毒后的叶柄用滤纸吸干水分，用刀片横切成厚度约1 mm的薄层，接种到诱导培养基中，诱导培养基编号为S1~S9。基础培养基选用SH培养基+30 g·L^-1蔗糖+8 g·L^-1琼脂，pH为5.95~6.00，共设置9种不同的生长调节剂组合（表1）。11个品种中AH、SMC、‘京华幻彩’的叶柄薄层接种于诱导培养基S1~S6，其余8个品种的叶柄薄层接种到诱导培养基S1~S9。每种处理接种32个叶柄薄层，重复3次，在45、75 d时继代一次。分生结节诱导培养条件为暗培养，温度为（23±1） ℃。

培养基S1是用于紫斑牡丹^［12］分生结节诱导的培养基，培养基S9是用于‘凤丹’^［13］分生结节诱导的培养基，培养基S6是用于GE^［14］分生结节增殖分化的培养基。

1.3　不定芽诱导

选取分生结节生长状况较好的HN、‘07-LB-19’、‘Oukan’、GE、AH、‘Bartzella’的6个品种进行分化培养。分化培养基编号为W1~W7，基础培养基为改良WPM［1 668 mg·L^-1 Ca（NO₃）₂·4H₂O］+30 g·L^-1蔗糖+6 g·L^-1琼脂，pH为5.95~6.00。依次设置7种不同的细胞分裂素处理：0.5 mg·L^-1 CPPU+0.5 mg·L^-1 TDZ、1.0 mg·L^-1 CPPU+0.5 mg·L^-1 TDZ、2.0 mg·L^-1 CPPU、4.0 mg·L^-1 CPPU、6.0 mg·L^-1 CPPU、8.0 mg·L^-1 CPPU、10.0 mg·L^-1 CPPU。‘07-LB-19’‘Oukan’的分生结节接种于培养基W1~W7，AH的分生结节接种于培养基W1~W2，HN、GE、‘Bartzella’的分生结节接种于培养基W3~W7。每个处理接种5个分生结节，重复3次，15 d继代一次。分生结节分化培养条件为光照强度32.4 μmol·m^-2·s^-1，光周期为14 h光照/10 h黑暗，温度为（23±1） ℃。

1.4　组织切片制作与观察

对诱导培养100 d的分生结节及正在分化不定芽的分生结节利用石蜡切片法进行组织学观察^［13］，LEICA RM2245切片机切片，番红固绿法染色，SDPTOP CX40显微镜观察并拍照。

1.5　数据统计与分析

统计11个品种自叶柄接入不同诱导培养基培养100 d时的分生结节诱导率、褐化率，以及在诱导培养基S4（0.5 mg·L^-1 NAA+1.0 mg·L^-1 CPPU）中培养60、75、100 d时的分生结节诱导率；统计6个品种的分生结节接种到分化培养基W1~W7中培养150 d后分化不定芽的频率（分化率）。

分生结节诱导率=（诱导出分生结节的外植体数量/接种外植体数量）×100%（1）

褐化率=（分生结节褐化数量/接种外植体数量）×100%（2）

分化率=（分化不定芽的分生结节数量/接种分生结节数量）×100%（3）

采用Adobe Photoshop CC 2019 处理照片，Origin 2022作图，Excel 2016和SPSS 27.0进行统计分析。

2 结果与分析

2.1　分生结节的诱导过程

叶柄薄层外植体（图1A）在诱导培养基中培养15 d时，叶柄横断面处生长出愈伤组织（图1B），培养30~45 d时愈伤组织明显增多（图1C、1D），培养60 d时多个品种愈伤组织底部接触培养基的部分出现了质地紧密的分生结节，培养100 d时所有品种均获得了一定数量的分生结节，且分生结节皆产生于愈伤组织贴近培养基的部位（图1E~1G）。观察培养100 d时分生结节的组织切片，发现内部的分生细胞以维管为中心做垂周分裂，周围环绕着薄壁细胞（图1H）。这一现象表明，以叶柄薄层为外植体在分生结节诱导培养基中连续培养60~100 d，可以获得分生结节；分生结节不是由外植体直接产生，而是由外植体先产生愈伤组织，然后在愈伤组织接触培养基的部位产生分生结节。

2.2　不同植物生长调节剂组合对分生结节诱导效果的影响

叶柄薄层在9种诱导培养基中培养100 d时，不同的生长调节剂组合之间对于诱导分生结节的效果有显著差异（图2）。培养基S3、S4、S5、S7可以在大部分品种中诱导出分生结节，其中培养基S3、S4、S5中均有4~5个品种可以获得50%以上的分生结节诱导率，而绝大部分品种在S7培养基中可以获得20%左右或更高的分生结节诱导率。相比之下，培养基S9在所有品种中都未诱导出分生结节，培养基S1仅在AH、‘07-LB-19’、‘Bartzella’中诱导出了分生结节。综合11个品 种的分生结节诱导表现可知，S3培养基的通用性最好，使用S3和S4两种培养基可以在绝大多数远缘杂交牡丹品种中实现较高效率的分生结节诱导。

比较这些培养基中植物生长调节剂的种类和质量浓度可以发现，分生结节诱导效果较好的 培养基中含有0.5 mg·L^-1 NAA及1.0~2.0 mg·L^-1 CPPU和（或）0.5~2.0 mg·L^-1的TDZ。当培养基中只有细胞分裂素而没有生长素时，无法诱导出分生结节，因此生长素对于诱导分生结节可能是必需的。与2，4-D相比，NAA诱导分生结节的效果更好。

2.3　不同远缘杂交牡丹品种诱导分生结节效果的差异

在本研究中，利用培养基S3、S4、S5、S7均可在组间、亚组间杂种中获得一定的分生结节诱导率，表明诱导分生结节的基本条件在亚组间杂种牡丹与组间杂种中可能是类似的；而S6培养基在组间杂种中诱导分生结节的效果好于亚组间杂种（图2）。

在8个亚组间杂种材料中，‘07-LB-19’、‘Oukan’、GE在S2~S7等多个培养基中均较容易诱导出分生结节，尤其是‘07-LB-19’在绝大部分培养基中的分生结节诱导率达到40%以上。HN的分生结节诱导率受生长调节剂影响较大，在S4培养基中高达80%以上，而在其他培养基中诱导率显著较低。SMC在所有供试培养基中都很难诱导出分生结节（图2）。

在供试的3个组间杂种中，LD和‘Bartzella’在多个培养基中均比较容易诱导获得分生结节，‘Bartzella’在S4~S7培养基中诱导率较高，达到42.71%~75.00%，LD在S3、S4~S8中皆可获得分生结节，其中在S3和S6中的诱导率较高，分别为61.46%和50.00%；而‘京华幻彩’较难诱导出分生结节，仅在S4培养基中获得了成功，诱导率为16.67%（图2）。

11个远缘杂交品种的叶柄在通用诱导培养基S4中培养60、75、100 d时分别统计分生结节诱导率，发现大部分品种的诱导率在100 d时达到最高，但SMC和LD的分生结节诱导率在75 d时达到最高，分别为25.00%和20.83%（表2），而在100 d时降低到0和7.29%（表2）。表明SMC和LD的分生结节诱导条件与其他品种没有本质区别，但需要及时转接到新的培养基中，否则容易褐化死亡。

2.4　分生结节的不定芽分化

选取6个分生结节生长状况较好的品种进行不定芽分化试验，最终在‘07-LB-19’‘Oukan’和AH共3个品种中实现了不定芽分化。‘07-LB-19’在培养基W1、W2中都分化出了不定芽，分化率分别为13.33%和33.33%，‘Oukan’、AH分别仅在W2、W1培养基中分化出不定芽，分化率分别为33.33%和6.67%（表3）。

分生结节在接种到分化培养基中15~30 d后，呈现多中心结节的状态（图3A），它的外部具有表皮和皮层组织（图3B），内部含有多个维管中心 （图3C）。在分化培养基中继代130 d时，分生结节表面开始分化不定芽（图3D）。此时分生结节 表面的薄壁细胞首先消失并出现由分生细胞聚 集的团状结构，形成顶端分生组织（图3E），然后 顶端分生组织与维管组织中心周围旺盛分裂的 细胞建立连接最终形成不定芽（图3F），继续继 代培养20~45 d后分生结节表面逐渐产生不定芽丛（图4）。

3 讨论

3.1　诱导牡丹分生结节步骤的简化

在已报道的牡丹及其他植物的分生结节诱导方法中，分生结节通常由两步获得，即首先将外植体放入仅含生长素，或同时含有细胞分裂素的培养基中诱导产生愈伤组织；然后将愈伤组织放入含有细胞分裂素和生长素，或者只含细胞分裂素的培养基中诱导产生分生结节^{［12-14，16-17］}。本研究发现，外植体在含有细胞分裂素和生长素的培养基中连续培养即可获得分生结节，证明将之前两步诱导分生结节的方法简化为一步是可行的。

虽然本研究实现了一步诱导牡丹分生结节，但是分生结节的发生过程仍然经历了愈伤组织阶段，说明一步法与两步法诱导的分生结节产生过程是类似的，都是由外植体通过愈伤组织间接产生，而非直接产生。其他植物的分生结节也都是间接产生的^［18-23］。

3.2　一步法诱导牡丹分生结节的关键条件

已有报道中，不同牡丹类群的分生结节诱导方法受基因型影响极大。但本研究发现，使用S3（0.5 mg·L^-1 NAA+1.0 mg·L^-1 CPPU+0.5 mg·L^-1 TDZ）和S4（0.5 mg·L^-1 NAA+1.0 mg·L^-1 CPPU）两种培养基可以在绝大多数远缘杂交牡丹品种中实现较高效率的分生结节诱导。培养基S1（0.5 mg·L^-1 2，4-D+4.0 mg·L^-1 6-BA）在两步法诱导牡丹分生结节的研究中成功诱导出了紫斑牡丹‘高原圣火’、亚组间杂种牡丹GE及HN、组间杂种‘Bartzella’的分生结节^{［12，14］}，但在本研究大部分材料中未能诱导出分生结节，整体效果远不及由NAA、CPPU、TDZ组成的其他培养基。这一现象表明，一步法诱导牡丹分生结节的条件与两步法可能有一定区别，细胞分裂素CPPU、TDZ和生长素NAA在一步法诱导牡丹分生结节中可能发挥关键作用。‘凤丹’子叶为外植体两步诱导分生结节时，先用含有NAA+CPPU的培养基诱导愈伤组织，然后用仅含有CPPU+TDZ而不含生长素的培养基诱导出分生结节^［13］。但本研究中仅含细胞分裂素而不含生长素的培养基S9中，所有品种均不能产生分生结节或愈伤组织，说明生长素在一步法诱导牡丹分生结节的过程中可能是必需的。

本研究表明，在生长素同为0.5 mg·L^-1 NAA时，同等浓度的CPPU诱导远缘杂种牡丹产生分生结节的效果明显优于TDZ，CPPU+TDZ的诱导效果也明显优于TDZ。在桉属（Eucalyptus）^［24］和‘凤丹’^［13］中，CPPU对于诱导分生结节也有较好的效果。但本研究中，当CPPU的质量浓度上升为4.0 mg·L^-1时，诱导效果明显下降，说明与在桉属植物中类似^［25］，高浓度的CPPU也抑制了牡丹分生结节的形成。

本研究发现，大部分远缘杂种牡丹的分生结节在100 d时的诱导率明显高于60~75 d时的诱导率，但有少数品种75 d的诱导率较高，100 d时反而因褐化死亡而分生结节诱导率降低。因此，对于这些品种，应及时将分生结节转接到新的培养基中进行后面的培养。这表明与啤酒花（Humulus lupulus）分生结节的诱导条件类似^{［17， 21］}，不同牡丹品种一步法诱导分生结节所需的时间也有一定差异。

3.3　牡丹分生结节分化不定芽的条件

牡丹分生结节的诱导通常在黑暗和极少继代的条件下进行^［12-14］，而光照和频繁继代是分生结节分化不定芽的关键条件^{［13-14，26］}。此外，细胞分裂素的种类和浓度也是诱导植物分生结节分化不定芽的重要条件^{［19，24，27-28］}。在本研究中，分生结节在有光照、每15 d继代一次的条件下，在含有0.5（或1.0） mg·L^-1 CPPU+0.5 mg·L^-1 TDZ的培养基中实现了 3个品种的不定芽分化，这一条件与‘凤丹’分生结节分化不定芽的条件是类似的^［13］。而有研究表明，GE分生结节需要在0.50 mg·L^-1 TDZ或0.25 mg·L^-1 NAA+0.50 mg·L^-1 TDZ的条件下分化不定芽^［14］。此外，本研究中分生结节在单独含有高浓度CPPU的培养基中分生结节保持生长，而无法分化不定芽。这表明与其他植物类似，较低浓度的细胞分裂素可能是诱导牡丹分生结节分化不定芽的主要因素^{［14，29-30］}，生长素在牡丹分生结节分化不定芽的过程中不是必需的。

4 结论

本研究表明，含有0.5 mg·L^-1萘乙酸（NAA）+ 1.0 mg·L^-1 氯吡脲（CPPU）+0.5（或0） mg·L^-1噻苯隆（TDZ）的SH培养基，可以作为在10个远缘杂种牡丹中一步诱导分生结节的通用培养基，诱导率可达到52.08%~83.33%；与两步法类似，一步法诱导的分生结节也是通过愈伤组织间接产生。较低浓度的CPPU和TDZ共同使用对于远缘杂种牡丹分生结节分化不定芽有促进作用，而单独使用高浓度的CPPU不利于不定芽分化；将分生结节接入含有0.5（或1.0） mg·L^-1 CPPU+0.5 mg·L^-1 TDZ的改良WPM培养基中，在光照、每15 d继代一次的条件下，可以诱导3个品种的不定芽分化，分化率为6.67%~33.33%。本研究筛选出了一步法诱导分生结节的通用培养基，并在部分品种中实现了不定芽分化，为建立远缘杂种牡丹植株再生体系提供了重要参考。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31971701)