变温层积不同阶段刺五加种子萌发生理及代谢特点

Characteristics of Temperature Stratification on Germination Physiology and Metabolism of Acanthopanax senticosus Seeds at Different Stages

摘要

为了探究刺五加（Acanthopanax senticosus）种子的休眠类型以及种子萌发过程中生理和代谢特征，以东北地区刺五加种子为研究对象，分别在不同温度条件（20 ℃，4 ℃，20 ℃/4 ℃）下对种子进行140 d沙藏层积处理。通过观察胚的表型变化，筛选出5个典型时期。研究5个典型时期种子中的内源激素、主要营养物质及其水解酶、抗氧化系统和代谢组学的动态变化规律。结果表明：（1）刺五加种子吸水性能良好，20 ℃恒温条件只能促进胚的伸长，不能萌发。4 ℃恒温条件下胚率无增长。只有0~110 d保持20 ℃恒温，110~140 d保持4 ℃恒温，胚率增长且种子能够萌发。（2）随着胚率增长，赤霉素含量上升，脱落酸含量下降，吲哚乙酸、吲哚丁酸和萘乙酸含量均下降；脂肪含量下降，可溶性糖含量上升。脂肪含量与脂肪水解酶活性呈显著负相关，与可溶性糖含量呈极显著负相关。（3）共筛选出92个差异代谢物，碳代谢、能量代谢和抗氧化代谢是主要的差异代谢通路。此外，倍半萜和三萜生物合成、脂肪酸生物合成、甘油脂类代谢等也存在差异。总之，刺五加种子属于形态生理性休眠，变温层积是打破种子休眠的必要条件，内源激素能够调控种子的休眠与萌发。脂肪等大分子营养物质被水解酶分解，为种子萌发提供物质和能量，这也是种子萌发的必要条件之一。该研究可为鉴定刺五加种子休眠类型以及人工繁殖提供理论依据。

Abstract

To investigate the dormancy type and physiological and metabolic characteristics of Acanthopanax senticosus seeds during germination， the seeds from northeast China were treated with sand accumulation for 140 days under different temperature conditions（20 ℃， 4 ℃， 20 ℃/4 ℃） respectively. Five distinct stages were identified based on embryo phenotypic changes，and the dynamic changes in endogenous hormones， main nutrient substances and their hydrolases， antioxidant system， and metabolomics during these five stages were examined respectively. The results revealed that： （1）A. senticosus seeds exhibited good water absorption； while the constant temperature of 20 ℃ only promoted embryo elongation， but not germination. There was no increase in embryo rate at 4 ℃， and the embryo rate increased and the seeds germinated only when the temperature was maintained at 20 ℃ for 0-110 d and 4 ℃ for 110-140 d. （2）As the embryo growth rate increased， gibberellic acid content increased while abscisic acid content decreased. The levels of indoleacetic acid， indolebutyric acid， and naphthenic acetic acid all decreased. Fat content decreased while soluble sugar content increased. Fat content showed a significant negative correlation with lipohydrolase activity as well as a highly significant negative correlation with soluble sugar content. （3）A total of 92 differential metabolites were screened， and the carbon metabolism， energy metabolism， and antioxidant metabolism were the major differential metabolic pathways. Additionally， there were difference in sesquiterpene and triterpene biosynthesis， fatty acid biosynthesis and glyceride metabolism. In conclusion， seeds of A. senticosus were morphological and physiological dormancy， and variable temperature stratification was a necessary condition to break seed dormancy， and endogenous hormones might regulate seed dormancy and germination. Macromolecular nutrients such as fat were decomposed by hydrolases to provide material and energy for seed germination， which was also one of the necessary conditions for seed germination. This study provided theoretical guidance for identifying seed dormancy types and artificial propagation of A. senticosus.

Graphical abstract

关键词

刺五加 / 休眠 / 萌发 / 变温层积 / 代谢组学 / 内源激素

Key words

Acanthopanax senticosus / dormancy / germination / variable temperature stratification / metabo-nomics / endogenous hormone

种子是植物繁殖后代的器官，为了保证种子能够萌发生长成为幼苗，植物进化出了各种机制^［1］，休眠是其中之一。种子休眠对植物育种及生产的影响是双向的。积极影响是可以使幼苗避开不利环境，播种的种子出苗更齐，且可以避免提前发芽，尤其是避免胎萌发生^［2］。负面影响是幼苗数量会减少，还增加了种子被动物、昆虫捕食的风险，提高了被微生物感染霉变的概率。

Baskin等^［3］将休眠分类系统细致划分为生理性休眠（Physiological dormancy，PD）、形态性休眠（Morphological dormancy，MD）、形态生理性休眠（Morphophysiology dormancy，MPD）、物理性休眠（Physical dormancy，PY）和组合性休眠（Physiological dormancy和Physical dormancy，PY+PD）。吉浴芳等^［4］发现毛叶山桐子（Idesia polycarpa）种子中存在萌发抑制物，属于生理性休眠，冷层积处理30 d或利用赤霉素处理能够显著提高萌发率。芹菜（Apium graveolens）种子是典型的形态性休眠类型，种子成熟时胚未发育成熟，胚占整个种子体积小，低温抑制萌发^［5］。天女木兰（Oyama sieboldii）的种子除种胚发育不成熟外，胚乳和假种皮会产生发芽抑制物质，因此属于形态生理性休眠^［6］。徐亮等^［7］发现野生大豆（Glycine soja）种子存在物理休眠，栅栏层使种皮不透水是其休眠的主要原因。紫楠（Phoebe sheareri）种子属于组合休眠类型，种皮致密抑制了种子的呼吸速率，导致物理休眠；同时，紫楠种子含有发芽抑制物质，具有生理休眠^［8］。

我国东北地区主要属于温带季风气候，为适应冬季低温恶劣环境，很多植物种子存在休眠特性，待春天温度和水分适宜时再完成萌发，以保护幼苗免受低温冻害，如北五味子（Schisandra chinensis）^［9］、刺人参（Oplopanax elatus）^［10］和黄精（Polygonatum sibiricum）^［11］。刺五加（Acanthopanax senticosus）广泛分布在我国东北林下，属于珍贵药用小灌木，主要药用部位是根茎，主要活性成分有刺五加苷B、刺五加苷E、异嗪皮啶等^［12］。刺五加已经被广泛应用于中国传统医药，Song等^［13］研究发现刺五加苷B和刺五加苷E对小鼠脑损伤有治疗作用。改善睡眠是刺五加主要功效之一，韩春霞等^［14］的试验证明刺五加根水煎剂能够延长小鼠睡眠时间，卞宏生等^［15］研究发现五加总苷、刺五加苷B均能改善果蝇（Drosophila melanogaster）睡眠。

刺五加种子存在休眠特性。1979年，周德本^［16］解剖了成熟刺五加种子，发现胚肉眼不可见，种子采收后在适宜的温度和湿度条件下沙藏210 d后即可萌发。周德本等^［17］、刘俊义等^［18］、韩承伟等^［19］先后研究发现，变温层积沙藏处理是打破刺五加种子休眠的有效方法。许怡玲^［20］首次提出刺五加种子休眠与代谢有关，田国伟等^［21］观察了刺五加种子结构并且研究了其营养化学成分。赵敏等^［22］研究表明，刺五加果实和种子中存在内源萌发抑制物质。为了打破种子休眠，李玉德^［23］、高成华^［24］、韩笑等^［25］采用不同浓度的赤霉素处理刺五加种子，结果表明赤霉素能够提高种子发芽率并且缩短了萌发时间。此外，沈宏伟等^［26-27］、付士朋等^［28］采用刺五加内生真菌、不同浓度的一氧化氮和过氧化氢溶液进行浸种处理，结果表明，不同处理方式都能够通过调节激素含量和抗氧化酶活性促进种子萌发。

上述研究表明，变温层积处理是刺五加种子萌发的重要条件。然而，对于变温层积处理不同阶段的种子生理和代谢特征的研究还鲜见报道。为此，本研究以20 ℃和4 ℃恒定温度处理的刺五加种子为对照组，探究以20 ℃/4 ℃变温处理的刺五加种子形态、生理生化和代谢物质变化特征，以期为鉴定刺五加种子休眠类型以及人工繁殖提供理论依据。

1 材料与方法

1.1　试验材料获取与处理

2021年10月于森林植物生态学教育部重点实验室（东北林业大学）室外苗圃一次性采集5年生刺五加植株的成熟紫色果实。果实用温水浸泡8 h后捣烂，揉搓淘洗后通风处阴干，用筛子去除破碎果肉部分，重复多次，直至剩下干净的种子。将种子温水浸泡8 h，去除漂浮在水面上的不饱满种子后于通风处阴干。最后得到干净且饱满的种子即为试验材料。

将480 g种子温水浸泡12 h后，平均分装到 24个尼龙网袋中，加入500 mL质量分数为0.3%的多菌灵消毒。提前将沙子放入烘箱，设定120 ℃高温灭菌2 h。无菌沙经过室温冷却后，用蒸馏水拌为湿沙，以手握能够结团即可。用容器装好湿沙，将种子埋于沙子中，种子和沙子的体积比为1∶3。种子分为3组：第1组进行20 ℃/4 ℃变温沙藏处理 （0~110 d保持20 ℃，110~140 d保持4 ℃）；第2组进行20 ℃恒温沙藏处理（140 d保持20 ℃）；第3组进行4 ℃恒温沙藏处理（140 d保持4 ℃）。

按划分阶段取样，用蒸馏水清洗干净，擦干表面水分，用液氮迅速冷冻，放置于冰箱-80 ℃保存。

1.2　测定指标与方法

1.2.1　种子和胚生长观察

利用游标卡尺测量刺五加种子的基本尺寸；随机取10粒种子，去掉种皮，沿种孔纵向将种子对半切开，利用显微镜观察胚的大小和形态。

\mathrm{胚率}=\frac{\mathrm{胚的}\mathrm{长度}}{\mathrm{去皮}\mathrm{种子}\mathrm{的长}\mathrm{度}}\times \mathrm{100}\mathrm{\%}（1）

1.2.2　种子主要营养物质解剖学观察

采用苏丹Ⅲ染液染色法观察种子中的脂肪。用刀片在去皮种子的横断面上平行切下若干薄片，放入盛有清水的培养皿中，从培养皿中选取较薄的切片，用毛笔蘸取放在载玻片中央；在种子薄片上滴2~3滴苏丹Ⅲ染液，染色3 min；用吸水纸吸去染液，再滴加1~2滴体积分数50%的乙醇溶液，洗去浮色；用吸水纸吸去种子薄片周围的乙醇，滴1滴蒸馏水，盖上盖玻片，制成临时装片。

采用碘-碘化钾染液染色法观察种子中的蛋白质和淀粉。从培养皿中选取较薄的切片，用毛笔蘸取放在载玻片中央；在种子薄片上滴2~3滴碘-碘化钾染液，染色3 min；用吸水纸吸去染液，再滴加1~2滴蒸馏水，洗去浮色；用吸水纸吸去种子薄片周围的蒸馏水，滴1滴蒸馏水，盖上盖玻片，制成临时装片。

最后，于徕卡正置荧光显微镜（DM4000B）下观察。

1.2.3　种子中主要营养物质转化及利用

采用石油醚索式提取法测定粗脂肪含量^［29］。取样品10 g，于烘箱60 ℃烘干至恒质量，研磨为粉末，记录干样质量。索氏提取器烘干至恒质量，记录石油醚回收瓶的质量。将干样品装入滤纸筒中，利用石油醚水浴恒温55 ℃抽提4 h。将装有回收石油醚的回收瓶放置烘箱中100 ℃烘至恒质量。计算2次回收瓶的质量差，即为粗脂肪质量。

采用蒽酮法测定可溶性糖含量^［30］。取样品0.5 g，置于研钵加入适当液氮研磨成粉末，加入蒸馏水10 mL煮沸30 min。将混合液放置台式高速冷冻离心机中，6 000 r·min^-1离心10 min。取上清液1 mL，用蒸馏水定容至10 mL。取1 mL定容稀释的试液，加入4 mL硫酸-蒽酮试剂，煮沸10 min。冷却后，利用紫外分光光度计（UV-6100，中国）于620 nm波长处测定。以葡萄糖为标准品，利用与样品测定相同的方法，绘制标准曲线。最后计算种子中可溶性糖的含量。

采用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白含量^［31］。取样品0.5 g，置于研钵加入适当液氮研磨成粉末，加入4 mL磷酸缓冲液（pH=7.8），摇匀。将混合液放置离心机中离心。取上清液0.1 mL，加入2.9 mL考马斯亮蓝溶液。反应2 min后，利用紫外分光光度计于595 nm波长处测定吸光度。以牛血清蛋白为标准品，利用与样品测定相同的方法，绘制标准曲线。最后计算种子中可溶性蛋白的含量。

蛋白质水解酶活力测定方法如下。取样品种子1 g，置于研钵加入适当液氮研磨成粉末，加入 6 mL（pH=6.0）磷酸缓冲液，充分混匀后离心，取上清液即为酶液。取样品酶液1 mL，加入10 g·L^-1的酪素1 mL，40 ℃水浴反应10 min，取出后离心。取上清液1 mL，加入5 mL浓度为0.4 mol·L^-1的碳酸钠溶液、1 mL福林酚试剂混匀，在水浴锅内40 ℃反应20 min。利用紫外分光光度计在680 nm波长处测定吸光度。以酪氨酸为标准品，利用与样品测定相同的方法，绘制标准曲线。最后计算种子中蛋白水解酶的活力。

脂肪水解酶活力测定方法如下。取10 mmol·L^-1对硝基苯酚棕榈酸酯（p-NPP）底物溶液20 μL，加入Tris-HCl缓冲液780 μL，37 ℃预热。5 min后加入200 μL酶液，反应10 min后加入1 mL浓度为0.5 mol·L^-1的三氯乙酸，混匀后静置5 min终止反应，再加入3 mL浓度为0.5 mol·L^-1的NaOH调节pH，于410 nm波长处测定吸光度。以对硝基苯酚（p-NP）为标准品，利用与样品测定相同的方法，绘制标准曲线。最后计算种子中脂肪水解酶的活力。

1.2.4　抗氧化酶活性和超氧阴离子产生速率的测定

采用氮蓝四唑光化还原法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性^［32］。取样品0.5 g，加入3 mL磷酸缓冲液（pH=7.8），摇匀。将混合液离心，取上清液即为酶液。SOD反应混合液包括162 mL浓度为14.5 mmol·L^-1的甲硫氨酸，0.6 mL浓度为30 μmol·L^-1的乙二胺四乙酸钠，6 mL浓度为60 μmol·L^-1的核黄素，6 mL浓度为2.25 mmol·L^-1的氮蓝四唑，5.4 mL磷酸缓冲液（pH=7.8）。取SOD反应混合液3 mL，加入30 μL酶液。再取SOD反应混合液3 mL，加入30 μL磷酸缓冲液作为对照。将试管放置 4 000 lx光照条件下反应20 min，利用紫外分光光度计在560 nm波长处测定吸光度。以抑制NBT光化还原50%所需要的酶量为1个酶活单位。

采用过氧化氢法测定过氧化氢酶（CAT）活性。CAT反应混合液包括200 mL磷酸缓冲液 （pH=7），0.31 mL质量分数为30 %的过氧化氢。取CAT反应混合液3 mL，加入酶液20 μL。利用紫外分光光度计的动力学模式在240 nm波长处测定吸光度。以每min吸光度值变化0.01为1个酶活单位（U）。

采用愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性^［33］。POD反应混合液包括200 mL磷酸缓冲液（pH=6），76 μL愈创木酚，112 μL质量分数为30%的过氧化氢。取POD反应混合液3 mL，加入50 μL酶液。利用紫外分光光度计的动力学模式在470 nm波长处测定吸光度。以每min吸光度值变化0.01为1个酶活单位（μ）。

采用羟胺氧化法测定超氧阴离子产生速率^［34］。取酶液0.5 mL，加入0.5 mL磷酸缓冲液（pH=7.8），加入1 mL浓度为1 mmol·L^-1的盐酸羟胺，摇匀后，25 ℃保温1 h。加入1 mL浓度为17 mmol·L^-1的对羟基苯磺酸，1 mL浓度为7 mmol·L^-1的α-萘胺，快速摇匀混合。在25 ℃保温20 min后，放置离心机中3 000 r·min^-1保持3 min，取上清液。利用紫外分光光度计在530 nm波长处测定吸光度。用KNO₂制作标准曲线，以\mathrm{N}{\mathrm{O}}_{\mathrm{2}}^{-}浓度乘以2作为O^2-浓度，计算样品中O^2-产生速率。

1.2.5　激素含量的测定

利用高效液相色谱（UPLC）系统和三重四极杆飞行时间（Q-TOF）串联质谱仪（Xevo G2-XSQTof，美国）测定激素含量^［35］。取0.5 g种子鲜样，置于研钵中用液氮研磨，加入3 mL预冷的体积分数为50%的乙腈，置于研磨器中震荡5 min，冰水浴超声3 min，低温离心10 min，取上清液。用Oasis HLB RP聚合物基SPE柱（Waters）纯化过滤，先依次加入预冷的3 mL纯甲醇、3 mL去离子水、 3 mL体积分数为50%的乙腈进行平衡，流出液用试管收集。再用3 mL体积分数为30%的乙腈冲洗，流出液用同一试管收集。将上清液使用真空旋转蒸发仪（LSE-3K，中国）浓缩挥干，加1 mL体积分数为30%的乙腈（LC-MS）复溶，装入衍生小瓶里上机检测。

1.2.6　初生代谢物的检测

使用安捷伦气相色谱仪和飞行时间质谱仪（7890A-5975C，美国）进行GC-MS分析。系统采用DB-5MS毛细管柱，以无分流模式注入1 μL样品。使用氦气作为载气，通过色谱柱的气体流速为 1 mL·min^-1。注入、传输线和离子源温度分别为280、280、250 ℃。在电子碰撞模式下，能量为-70 eV。溶剂延迟6.35 min后，以12.5个/s光谱的速率，在m/z范围为50~500的全扫描模式下获得质谱数据。样品制备参考刘洋^［36］的前处理方法。

1.3　数据分析

使用IBM SPSS Statistics 22.0软件进行统计分析。使用GraphPad Prism 8.0.2软件绘制柱形图。使用Photoshop 2023对拍摄图片整理拼接。GC-MS数据使用Agilent GC-MS 5975软件处理，并采用XCMS软件包进行数据的特征峰提取和预处理。将预处理完毕的数据矩阵归一化后导入SIMCA 14.1软件进行PCA分析和PLS-DA等多元统计分析，得到各变量对分组贡献得分（VIP值）大于1的代谢物。利用IBM SPSS Statistics 22.0进行独立样本t检验，得到组间变化显著的（P<0.05）代谢物。将VIP值>1，P<0.05且|log₂FoldChange|>2的代谢物作为差异代谢物，并将差异代谢物输入KEGG数据库和Metaboanalyst数据库进行代谢途径筛选。

2 结果与分析

2.1　刺五加种子休眠类型

对刺五加种子（见图1A，a）进行观察统计，结果可知，种子包括种皮（见图1A，c，d）、胚乳（见图1A，b）和被包裹住的胚（见图1B，0d）。种子长（5.07±0.60） mm，宽（2.61±0.23） mm，厚（0.85±0.13） mm，千粒质量为（4.67±0.24） g，胚率为（4.20±0.14）%。为了探究种子萌发条件，设置3个温度对种子进行萌发试验。结果显示，20 ℃的恒温条件只能促进胚的伸长，种子不能发芽。4 ℃恒温条件下胚率无增长。只有在0~110 d保持20 ℃恒温，110~140 d保持4 ℃恒温，胚率增加且种子能够发芽（见图2A）。以上结果说明，20 ℃的相对高温是胚生长的关键，4 ℃的低温是胚根刺破胚乳细胞，致使种子萌发的关键。根据胚的生长表型差异（见图1B）和胚率变化曲线（见图2A），选取20 ℃/4 ℃变温处理种子0、50、80、110、140 d作为典型时期探究打破种子休眠机制，将这5个时期标记为S1、S2、S3、S4和S5。

为了判断种子休眠的类型，一方面，对种子的吸水性进行测试（见图2B）。结果表明，10 g完整种子浸泡在水中24 h，去掉种皮后的质量为（6.630±0.011） g。10 g完整种子先去掉种皮，质量为（5.260±0.013） g，再浸泡24 h，质量为（6.330±0.013） g。两种处理的种子，在吸水24 h后无种皮部分的质量无显著差异，说明种皮具有透水性，在20 ℃处理种子的试验过程中，发现95 d时种皮就已经开裂，因此排除物理休眠（PY）。

另一方面，对种子中存在的主要抑制种子萌发的物质进行探究。脱落酸和赤霉素含量的比值是种子萌发或休眠的开关^［37］。因此本研究中测定了5个时期种子中的脱落酸和赤霉素含量。此外，还测定了3种生长素（吲哚乙酸、吲哚丁酸、萘乙酸）和3种细胞分裂素（玉米素、6-苄氨基腺嘌呤、激动素）的含量。结果表明，脱落酸含量呈下降趋势，赤霉素含量呈升高趋势，脱落酸与赤霉素含量的比值是显著降低的趋势（见图3A）。3种生长素和3种细胞分裂素的含量整体也呈下降趋势（见图3B，3C）。利用胚率与激素含量进行相关性分析（见图4），结果表明，玉米素、激动素含量与胚率无显著相关性，赤霉素的含量与胚率极显著正相关。

脱落酸、吲哚丁酸、6-苄氨基腺嘌呤的含量胚率有极显著负相关性，吲哚乙酸和萘乙酸含量与胚率有显著负相关性，这说明除了脱落酸和赤霉素能够调控种子的休眠与萌发外，一些生长素和细胞分裂素可能也具备维持种子休眠的功能。

刺五加种子不属于物理休眠（PY），它的胚表现出了形态性休眠（MD）的特征。种子中存在的脱落酸能够阻碍萌发，随着沙藏层积处理，促进种子萌发的赤霉素含量显著上升，这些都符合形态生理性休眠（MPD）的特征。因此，确定刺五加种子属于形态生理性休眠（MPD）。

2.2　刺五加种子主要营养物质的分布、转化和利用

种子的营养物质主要包括淀粉、脂肪、蛋白质，以此将种子分类为淀粉种子、脂肪种子和蛋白质种子。利用苏丹Ⅲ染液和碘-碘化钾染液对种子染色，然后将种子纵向切开，放在显微镜下观察。结果发现，脂肪经过苏丹Ⅲ染液染色为橘黄色，蛋白质经过碘-碘化钾染液染色为金黄色，淀粉经过碘-碘化钾染液染色为蓝色。本试验表明，从S1到S5，脂肪的变化趋势是由大颗粒分解为小颗粒，分布得更加均匀，含量减少（见图5A，6A）。蛋白质的分布无明显变化（见图5B），S3时期含量最高（见图6B）。种子没有被染色为蓝色，说明成熟的种子中不含淀粉。有研究表明，在油菜（Brassica napus）种子发育时期能够在种子中检测到淀粉粒，但淀粉粒的数量随着种子发育逐渐减少。与淀粉合成相关的重要基因大多在种子发育早期高表达，然后随着种子发育逐渐降低。这些结果可能表明，在种子发育早期合成了大量的淀粉，为种子发育后期的脂肪合成提供能量^［38］。植物中，糖类才是能够直接利用的供能物质，其他物质只能通过一些代谢反应转变为糖类，进而被利用。从S1到S5，胚胎生长发育消耗能量，但是可溶性糖含量依旧上升（见图6A），这得益于脂肪水解酶能够将脂肪分解为甘油和脂肪酸，甘油可以进一步转化为糖类，脂肪酸则经过β氧化进入乙醛酸循环，进一步生成琥珀酸为柠檬酸循环提供底物。

活性氧（ROS）是生物正常代谢的天然副产物。当植物受到胁迫时，ROS产生的速率会急剧提高，可能会对细胞结构造成严重损害，这被称为氧化应激。然而，近年来有研究表明，ROS在细胞信号传导和体内平衡中具有重要作用，在调节种子休眠和萌发中也有重要作用^［39］。本研究中发现SOD和POD活性是上升的趋势，保证了ROS的产生速率处于平稳状态（见图7）。

相关性分析结果显示（见表1），胚率与粗脂肪含量、蛋白质水解酶活性呈极显著负相关，胚率与可溶性糖含量、SOD活性、POD活性呈极显著正相关，粗脂肪含量与可溶性糖含量呈极显著负相关，进一步证明了脂肪能够分解转化为糖类。

2.3　刺五加种子萌发过程中代谢组学分析

对5个时期的样本进行了非靶向代谢组学检测，PCA结果显示5个时期的代谢谱存在差异（见图8A）。根据P<0.05，VIP值>1的原则，筛选出92个差异代谢物（见图8B）。进而，对差异代谢物进行KEGG富集分析（见图9）。结果表明，碳代谢（半乳糖代谢、淀粉和蔗糖代谢、果糖和甘露糖代谢），能量代谢（丙酮酸代谢、糖酵解/糖异生、柠檬酸循环），抗氧化代谢（谷胱甘肽代谢、抗坏血酸代谢）是主要的差异代谢通路。此外，倍半萜和三萜生物合成、脂肪酸生物合成、甘油脂类代谢等也是重要的差异代谢通路。

2.4　刺五加种子萌发过程能量代谢网络模式

基于差异代谢通路绘制了种子萌发过程中能量代谢网络模式图（见图10）。脂肪的主要成分是三酰甘油，储存在油体中，经过脂肪水解酶水解为甘油和脂肪酸，脂肪酸进入乙醛酸循环体经过β氧化生成乙酰辅酶A，乙醛酸循环直接与β氧化途径耦联，接受乙酰辅酶A。乙醛酸循环中产生的琥珀酸进入线粒体加入三羧酸循环。生成的草酰乙酸在细胞质中转化为磷酸烯醇式丙酮酸，最终生成蔗糖。甘油经过磷酸化生成3-磷酸甘油酸，进入线粒体被氧化为磷酸二羟丙酮，其与3-磷酸甘油醛为同分异构体，随后在细胞质中被醛缩酶合成蔗糖。生成的蔗糖可直接分解为葡萄糖进入糖酵解途径，进而进入三羧酸循环，为细胞提供大量能量。生成的蔗糖也可运送至胚中再加以利用，或运送至液泡中储存起来，必要时运送至需要的位置利用。本研究中，油酸是主要的差异代谢脂肪酸，在S2时期积累量最高。甘油、3-磷酸甘油酸、蔗糖、苹果酸和柠檬酸含量均是在S3和S4时期最高。果糖和乳酸的含量在S1时期最高，然后下降。

3 讨论

刺五加果实在9、10月成熟，自然条件下，刺五加种子需要越冬再经第2年夏季后到第3年春季才能萌发^［40］，且种子萌发率仅为0.5%~16.8%^［41］。但邢朝斌等^［42］利用变温沙藏层积处理刺五加种子使其在160 d时萌发率达到62.7%。因此变温沙藏是刺五加种子萌发的关键条件。马淑兰^［43］对刺五加种子休眠机理研究表明，胚发育状况和内源萌发抑制物是刺五加种子休眠的主要原因。本研究将种子变温沙藏处理140 d，利用解剖学观察试验发现胚由球形胚发育为子叶胚，胚率由（4.20±0.14）%增加至（88.59±4.21）%，利用高效液相色谱与质谱连用技术检测激素含量，结果显示脱落酸与赤霉素含量的比值下降，并且相关性分析显示该比值与胚率有极显著负相关（见图4）。这些特征符合形态生理性休眠类型（MPD），这与李晓琳等^［44］对刺五加种子的描述一致。

种子萌发的必要条件分为内部条件和外部条件。外部条件包括温度和湿度等，内部条件主要包括完整成熟的胚和供种子萌发的能量。种子中的淀粉、蛋白质和脂肪等大分子贮藏物质分解代谢为小分子营养物质和能量供种子萌发所用^［45］。本研究中，利用临时切片法和染色法观察到刺五加种子中的主要营养大分子物质是脂肪和蛋白质，种子经过碘-碘化钾染液染色后没有呈现蓝色，因此种子中未贮存淀粉。对直接供能物质定量检测发现，可溶性糖在S2~S3时期开始积累。田国伟等^［21］的刺五加种子染色试验也证明了胚乳细胞内贮存了大量体积较大的蛋白质和脂肪，但未见贮存淀粉粒，并且变温层积45 d时胚细胞中开始积累多糖颗粒。

本研究中，S3时期脂肪水解酶活性升高（见图6A），应该生成更多的脂肪酸，但脂肪酸含量却大幅下降，这可能是因为乙醛酸循环体在S3时期才大量发育为完全体，这与利用水和电等方式促进胡萝卜种子中乙醛酸循环体提前出现的现象一致^［46］。此时β氧化水平提高，产生了大量过氧化氢，过氧化氢的积累有助于破坏胚乳细胞，为胚提供营养物质和生长空间。此外，CAT的活性在S4时期显著升高，推测是为了避免胚细胞被过氧化氢伤害（见图7C）。利用GC-MS对种子初生代谢水平检测，结果显示苹果酸、柠檬酸均在S3和S4时期积累最高，说明此时三羧酸循环加强，可能是因为随着胚的发育，胚周围结构限制被缓解，种子突破低氧限制，线粒体才变得活跃^［47］。甘油、磷酸甘油酸、葡萄糖、蔗糖等同样是在S3和S4时期含量最高，说明此时种子内部的代谢水平活跃，胚生长速度最快（见图1B）。差异代谢通路中倍半萜和三萜生物合成也处于重要位置，这也能够说明赤霉素的代谢与种子萌发相关，有研究表明赤霉素能够促进多种水解酶的合成^［48］。

刺五加种子休眠是为了度过寒冷漫长的冬季，生理性休眠在4 ℃的环境中被解除，这是种子进化出感知早春到来的响应机制。本试验过程中发现种子在形态成熟后，可以在4 ℃的湿沙子中完成生理成熟并萌发，但只是胚轴伸长，子叶不会伸展。将种子播种在室温，发现是胚轴伸长将种子顶出土壤后，子叶展开，胚进入自养期，这是对光的响应。Wang等^［49］对拟南芥（Arabidopsis thaliana）研究发现，拟南芥幼苗在黑暗中发芽后，会经历先发钩、闭合子叶和快速伸长下胚轴。在光感知下，幼苗去黄化，顶钩和子叶开放，光信号关闭SAUR17并上调SAUR亚组，包括钩细胞和子叶细胞内侧的SAUR50，导致细胞扩增和子叶展开。因此为了避免种子在进入自养期前将胚乳中的能量耗尽导致胚死亡，在人工繁育刺五加时，应把控生理成熟时间不宜太长，且不宜播种太深，这样才能促进刺五加种子萌发，提高人工繁育的成功率。

参考文献

[1] NONOGAKI H.Seed dormancy and germination-emerging mechanisms and new hypotheses［J］.Frontiers in Plant Science，2014，5：233.

[2] YAO M Q， CHEN W W， KONG J H，et al. METHYLTRANSFERASE1 and ripening modulate vivipary during tomato fruit development［J］.Plant Physiology，2020，183（4）：1883-1897.

[3] BASKIN J M， BASKIN C C.A classification system for seed dormancy［J］.Seed Science Research，2004，14（1）：1-16.

[4] 吉浴芳，宋松泉，刘军，等.毛叶山桐子种子休眠与萌发特性的研究［J］.中国野生植物资源，2023，42（6）：23-28.

[5] JI Y F， SONG S Q， LIU J，et al.Study on characteristics of dormancy and germination in Idesia polycarpa seeds［J］.Chinese Wild Plant Resources，2023，42（6）：23-28.

[6] 李涵，阎君，吴珏，等.低温诱导芹菜种子次生休眠及其调控机制［J］.南京农业大学学报，2023，46（5）：833-840.

[7] LI H， YAN J， WU Y，et al.Low temperature induced secondary dormancy of celery seeds and its regulatory mechanism［J］.Journal of Nanjing Agricultural University，2023，46（5）：833-840.

[8] 李金航，葛丽丽，杜凤国，等.天女木兰研究热点及展望：基于Citespace的可视化计量［J］.北华大学学报（自然科学版），2023，24（6）：712-721.

[9] LI J H， GE L L， DU F G，et al.Research hotspots and prospects of Oyama sieboldii：based on visuabibliometrics via Citespace［J］.Journal of Beihua University（Natural Science Edition），2023，24（6）：712-721.

[10] 徐亮，李建东，殷萍萍，等.野生大豆种皮形态结构和萌发特性的研究［J］.大豆科学，2009，28（4）：641-646.

[11] XU L， LI J D， YIN P P，et al.Testa morphology structure and germination characteristic of Glycine soja ［J］.Soybean Science，2009，28（4）：641-646.

[12] 邢露，李铁华，何功秀，等.紫楠种子的休眠与萌发特性［J］.中南林业科技大学学报，2023，43（6）：43-50.

[13] XING L， LI T H， HE G X，et al.Seed dormancy and germination characteristics of Phoebe sheareri ［J］.Journal of Central South University of Forestry and Technology，2023，43（6）：43-50.

[14] 王炎，赵敏，俞加林.北五味子种子休眠特性及内源抑制物质的研究［J］.中国中药杂志，1997（1）：11-13.

[15] WANG Y， ZHAO M， YU J L.A study on the dormancy characteristic and inner inhibitory substances of Fructus schisandrae ［J］.China Journal of Chinese Materia Medica，1997（1）：11-13.

[16] 赵阳，刘迪，樊磊，等.东北刺人参种子实用催芽技术研究［J］.现代园艺，2019（2）：15-17.

[17] ZHAO Y， LIU D， FAN L，et al.The analysis of germination effectiveness of Oplopanax elatus seed with different stratification treatment［J］.Modern Horticulture，2019（2）：15-17.

[18] 缪璐琳，谢艳，刘森，等.黄精的繁殖及种植技术研究进展［J］.种子科技，2022，40（2）：70-72.

[19] MIAO L L， XIE Y， LIU S，et al.Research progress on propagation and planting techniques of Polygonatum sibiricum ［J］.Seed Science and Technology，2022，40（2）：70-72.

[20] JIN L， SCHMIECH M， GAAFARY M E，et al.A comparative study on root and bark extracts of Eleutherococcus senticosus and their effects on human macrophages［J］.Phytomedicine，2020，68：153181.

[21] SONG C， LI S J， DUAN F Y，et al.The therapeutic effect of Acanthopanax senticosus components on radiation-induced brain injury based on the pharmacokinetics and neurotransmitters［J］.Molecules，2022，27（3）：1106.

[22] 韩春霞，李廷利，郭冷秋.刺五加水煎剂改善睡眠作用研究［J］.中华中医药学刊，2007，25（10）：2084-2085.

[23] HAN C X， LI T L， GUO L Q.Sleep effects of aqueous extract manyprickle Acanthopanax senticosus root［J］.Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine，2007，25（10）：2084-2085.

[24] 卞宏生，蔡江莹，杨凡静暄.刺五加总苷及刺五加苷B对持续黑暗条件下果蝇睡眠-觉醒节律的量效关系研究［J］.中国药物依赖性杂志，2020，29（3）：231-236.

[25] BIAN H S， CAI J Y， YANG F J X.Study on the dose-effect relationship of acanthopanax total glycoside and eleutheroside B on sleep-wake rhythm in Drosophila melanogaster under continuous darkness［J］.Chinese Journal of Drug Dependence，2020，29（3）：231-236.

[26] 周德本.刺五加种子的处理方法［J］.林业科技通讯，1979（6）：2.

[27] ZHOU D B.Treatment of Acanthopanax senticosus seeds［J］.Forest Science and Technology，1979（6）：2.

[28] 周德本，王桂堂，王云霞.刺五加的种子与扦插繁殖［J］.中草药，1981，12（8）：34-36.

[29] ZHOU D B， WANG G T， WANG Y X.Seeds and cutting propagation of Acanthopanax Senticosus ［J］.Chinese Traditional and Herbal Drugs，1981，12（8）：34-36.

[30] 刘俊义，薛茂贤，程丽雅，等.刺五加种子育苗技术的研究［J］.中国林副特产，1992（2）：5-6.

[31] LIU J Y， XUE M X， CHENG L Y，et al.Study on seed seedling raising technology of Acanthopanax senticosus ［J］.Forest By-Product and Speciality in China，1992（2）：5-6.

[32] 韩承伟，明兆清，闫思维，等.刺五加种子催芽处理方法的研究［J］.中国林副特产，1994（1）：1-2.

[33] HAN C W， MING Z Q， YAN S W，et al.Study on the method of accelerating the germination of Acanthopanax senticosus seeds［J］.Forest By-Product and Speciality in China，1994（1）：1-2.

[34] 许怡玲.刺五加种子后熟期间的发育过程与代谢的相关［J］.中国林副特产，1989（4）：7-10.

[35] XU Y L.Correlation between the development process and metabolism of Acanthopanax senticosus seeds during post-ripening［J］.Forest By-Product and Speciality in China，1989（4）：7-10

[36] 田国伟，刘林德，王仲礼，等.刺五加种子结构、后熟作用及其细胞化学研究［J］.西北植物学报，1999，19（1）：7-13.

[37] TIAN G W， LIU L D， WANG Z L，et al.Studies on seed structure，after-ripening and cytochemistry of Acanthopanax senticosus ［J］.Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，1999，19（1）：7-13.

[38] 赵敏，王炎，康莉.刺五加果实及种子内源萌发抑制物质活性的研究［J］.中国中药杂志，2001，26（8）：534-538.

[39] ZHAO M， WANG Y， KANG L.Studies on the activity of endogenous germination inhibitors in Acanthopanax senticosus fruits and seeds［J］.China Journal of Chinese Materia Medica，2001，26（8）：534-538.

[40] 李玉德.药剂处理对刺五加种子发芽率的影响［J］.农业科技与装备，2014（1）：18-19.

[41] LI Y D.Effect of chemical treatment on the germination rate of Acanthopanax senticosus seeds［J］.Agricultural Science and Technology and Equipment，2014（1）：18-19.

[42] 高成华.外源GA对刺五加种子后熟过程中内源激素含量变化的影响［J］.种子，2016，35（1）：35-37.

[43] GAO C H.Effect of exogenous GA on the changes of endogenous hormone content in Acanthopanax senticosus seeds during post-ripening［J］.Seed，2016，35（1）：35-37.

[44] 韩笑，李悦，逄东霖，等.化学方法处理对刺五加种子萌发特性的影响［J］.吉林农业，2019（18）：46-48.

[45] HAN X， LI Y， PANG D L，et al.Effects of chemical treatments on the germination characteristics of Acanthopanax senticosus seeds［J］.Jilin Agriculture，2019（18）：46-48.

[46] 沈宏伟，张爽，付士朋，等.内生真菌对刺五加种子萌发过程激素及酶含量变化的影响［J］.中草药，2019，50（3）：716-721.

[47] SHEN H W， ZHANG S， FU S P，et al.Effects of endophytic fungi on the changes of hormone and enzyme contents during the germination of Acanthopanax senticosus seeds［J］.Chinese Traditional and Herbal Drugs，2019，50（3）：716-721.

[48] 沈宏伟，张爽，李佳宾，等.不同浓度的外源NO对刺五加种子激素及酶含量变化的影响［J］.中国实验方剂学杂志，2019，25（3）：137-142.

[49] SHEN H W， ZHANG S， LI J B，et al.Effects of exogenous NO with different concentrations on the changes of hormones and enzymes in Acanthopanax senticosus seeds［J］.Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，2019，25（3）：137-142.

[50] 付士朋，沈宏伟，王谦博，等.基于灰色关联度法分析刺五加种子中胚率、内源激素和酶活力的相关性［J］.中国实验方剂学杂志，2020，26（4）：145-151.

[51] FU S P， SHEN H W， WANG Q B，et al.Correlation analysis of embryo rate，endogenous hormones and enzyme activity in Acanthopanax senticosus seeds based on grey correlation degree method［J］.Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，2020，26（4）：145-151.

[52] DZONDO-GADET M， NZIKOU J M， KIMBONGUILA A，et al.Solvent and enzymatic extraction of Safou and Kolo oils［J］.European Journal of Lipid Science and Technology，2004，106（5）：289-293.

[53] FENG J， DONG P， LI R M，et al.Effects of wood fiber properties on mold resistance of wood polypropylene composites［J］.International Biodeterioration & Biodegradation，2019，140：152-159.

[54] WU Y， SHEN Y B.Dormancy in Tilia miqueliana is attributable to permeability barriers and mechanical constraints in the endosperm and seed coat［J］.Brazilian Journal of Botany，2021，44（3）：725-740.

[55] PAN C L， LU H L， YU J F，et al.Identification of cadmium-responsive Kandelia obovata SOD family genes and response to Cd toxicity［J］.Environmental and Experimental Botany，2019，162：230-238.

[56] LI P X， HU H L， LUO S F，et al.Shelf life extension of fresh lotus pods and seeds（Nelumbo nucifera Gaertn.） in response to treatments with 1-MCP and lacquer wax［J］.Postharvest Biology and Technology，2017，125：140-149.

[57] 彭旭阳，董成虎，赵晓梅，等.臭氧处理对冬枣贮藏品质的影响［J］.食品研究与开发，2023，44（21）：26-32.

[58] PENG X Y， DONG C H， ZHAO X M，et al.Effect of ozone treatment on storage quality of winter jujube［J］.Food Research and Development，2023，44（21）：26-32.

[59] 杜丹丹.平茬对杜仲幼苗及腋芽生长调节的机理研究［D］.哈尔滨：东北林业大学，2021.

[60] DU D D.Study on the growth regulation mechanism of pruned on the Eucommia ulmoides Oliv.saplings and axillary buds［D］.Harbin：Northeast Forestry University，2021.

[61] 刘洋.应用代谢组学对比研究两种黄芪响应UV-B和干旱胁迫的代谢基础［D］.哈尔滨：东北林业大学，2018.

[62] LIU Y.Comparative study on the metabolic basis of two Astragalus membranaceus species in response to UV-B and drought stress by metabonomics［D］.Harbin：Northeast Forestry University，2018.

[63] CHEN Y， XIANG Z P， LIU M，et al.ABA biosynthesis gene OsNCED3 contributes to preharvest sprouting resistance and grain development in rice［J］.Plant，Cell and Environment，2023，46（4）：1384-1401.

[64] CHEN K， YIN Y T， DING Y R，et al.Characterization of oil body and starch sranule dynamics in developing seeds of Brassica napus ［J］.International Journal of Molecular Sciences，2023，24（4）：4201.

[65] JURDAK R，DE ALMEIDA GARCIA RODRIGUES G， CHAUMONT N，et al.Intracellular reactive oxygen species trafficking participates in seed dormancy alleviation in Arabidopsis seeds［J］.New Phytologist，2022，234（3）：850-866.

[66] 徐绍娣，李辉，张顺捷.刺五加实生苗生产中存在问题与分析［J］.中国林副特产，2017（5）：95-96.

[67] XU S D， LI H， ZHANG S J.Problems and analysis in the production of Acanthopanax senticosus seedlings［J］.Forest By-Product and Speciality in China，2017（5）：95-96.

[68] 崔立勇，佟庆，史伟国，等.光照对刺五加种子萌发和幼苗生长的影响［J］.西北农业学报，2015，24（8）：157-164.

[69] CUI L Y， TONG Q， SHI W G，et al.Effects of light intensity on seed germination and seedling growth of Acanthopanax senticosus ［J］.Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica，2015，24（8）：157-164.

[70] 邢朝斌，沈海龙，黄剑，等.不同温度、时间层积处理对刺五加种子发芽的影响［J］.辽宁林业科技，2006（5）：9-11.

[71] XING C B， SHEN H L， HUANG J，et al.Effects of stratification at different temperature and time on seed germination of Eleutherococcus senticosus ［J］.Liaoning Forestry Science and Technology，2006（5）：9-11.

[72] 马淑兰.刺五加种子休眠机理研究［D］.长春：吉林农业大学，2006.

[73] MA S L.Study on the dormancy mechanism of Acanthopanax senticosus seed［D］.Changchun：Jilin Agricultural University，2006.

[74] 李晓琳，黄璐琦，李颖，等.刺五加种子质量分级标准研究［J］.现代中药研究与实践，2017，31（2）：50-53.

[75] LI X L， HUANG L Q， LI Y，et al.Research on seed quality grading standard of Acanthopanax senticosus seeds［J］.Research and Practice on Chinese Medicines，2017，31（2）：50-53.

[76] 潘学军，李德燕，张文娥.贵州野生刺葡萄和腺枝葡萄种子萌发生理特性的研究［J］.北方园艺，2010（6）：15-17.

[77] PAN X J， LI D Y， ZHANG W E.The germinating physiological characteristic of wild vitis（V.davidii and V.adenoclada） native in Guizhou Province［J］.Northern Horticulture，2010（6）：15-17.

[78] ZHAO S， GARCIA D， ZHAO Y L，et al.Hydro-electro hybrid priming promotes carrot（Daucus carota L.） seed germination by activating lipid utilization and respiratory metabolism［J］.International Journal of Molecular Sciences，2021，22（20）：11090.

[79] 张彩华.胡杨和灰杨种子萌发盐胁迫的转录组研究［D］.兰州：兰州大学，2022.

[80] ZHANG C H.Transcriptomic analyses of seed germination under salt stress in Populus euphratica and Populus pruinosa ［D］.Lanzhou：Lanzhou University，2022.

[81] 茹刚，陈学林，王桠楠，等.西伯利亚乌头种子休眠及破除方法的研究［J］.中药材，2020，43（2）：280-285.

[82] RU G， CHEN X L， WANG Y N，et al.Study on seed dormancy and breaking methods of Aconitum sibiricum ［J］.Journal of Chinese Medicinal Materials，2020，43（2）：280-285.

[83] WANG J J， SUN N， ZHANG F F，et al.SAUR17 and SAUR50 differentially regulate PP2C-D1 during apical hook development and cotyledon opening in Arabidopsis ［J］.The Plant Cell，2020，32（12）：3792-3811.

基金资助

黑龙江省种业创新项目(ZQTYB231700002)

东北林业大学大学生创新训练计划项目(202310225471)