小黑杨Rubisco小亚基基因启动子的克隆及表达活性分析

Cloning and Expression Activity Analysis of Rubisco Small Subunit Gene Promoter in Populus × xiaohei

摘要

核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）是光合作用中决定碳同化速率的关键酶，其中小亚基（rbcS）是由核基因编码，并且主要在叶片中表达。利用RT-qPCR技术确定了小黑杨（Populus×xiaohei）叶片中高表达的Rubisco小亚基基因PxrbcS1和PxrbcS2基因，并克隆了其上游2 240、2 174 bp的启动子。对其进行启动子元件分析结果表明，PxrbcS1和PxrbcS2的启动子具有多个与光诱导表达相关的元件，例如G-box、MRE和Box 4等元件。构建pBI-121-pPxrbcS1：：GUS和pBI-121-pPxrbcS2：：GUS植物表达载体并遗传转化84K杨（P. alba× P. glandulosa）。GUS组织化学染色以及qPCR表达分析表明PxrbcS1和PxrbcS2的启动子能够驱动GUS基因在84K杨叶片特异性高表达。总之，上述结果表明该研究成功地从小黑杨中克隆了具有叶片高表达活性的PxrbcS1和PxrbcS2的启动子，该启动子可应用到包括杨树在内的植物光合作用相关的基因功能研究以及提高植物光合作用的遗传操作中。

Abstract

Ribulose-1，5-diphosphate carboxylase/oxygenase（Rubisco） is a key enzyme in photosynthesis， in which small subunits（rbcS） are encoded by nuclear genes and mainly expressed in leaves. In this study， the Rubisco small subunit genes PxrbcS1 and PxrbcS2， which are highly expressed in Populus × xiaohei’s leaves， were determined by RT-qPCR technology， and their upstream promoters of 2 240 and 2 174 bp were cloned respectively. The results of promoter element analysis showed that the promoters of PxrbcS1 and PxrbcS2 had multiple elements related to light induced expression， including G-box， MRE and Box4 elements. Plant expression vectors of pBI-121-pPxrbcS1：：GUS and pBI-121-pPxrbcS2：：GUS were constructed and genetically transformed into 84K poplar（P. alba×P. glandulosa）. GUS histochemical staining and qPCR expression analysis showed that the promoters of PxrbcS1 and PxrbcS2 could drive the GUS gene to express in 84K poplar leaves with high specificity. In conclusion， the above results showed that PxrbcS1 and PxrbcS2 promoters with high leaf expression activity were successfully cloned from P.×xiaohei， and the promoters might be applied to the study of gene functions related to plant photosynthesis and genetic operations to improve photosynthesis in plants， including poplars.

Graphical abstract

关键词

杨树 / Rubisco小亚基启动子 / 克隆 / 调控元件 / 遗传转化 / GUS染色。

Key words

Poplar / rubisco small subunit promoter / cloning / regulatory element / genetic transformation / GUS staining

启动子是RNA聚合酶识别、结合和启动转录的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，启动子决定着基因表达的组织特异性以及表达量^［1］。启动子可分为3类：组成型启动子、组织特异型启动子、诱导型启动子^［2］。在植物的基因工程育种中，组成型启动子，如花椰菜病毒CaMV35S能驱动外源基因在植物组织和器官的任意部位表达^［3-4］，但基因表达的时空性不能有效控制，因此实践中存在一定缺陷。组织特异型启动子只在特定的生长阶段或组织部位高效启动基因表达。在植物的遗传转化中运用组织特异型启动子控制目标基因的表达能更有效地避免使用组成型启动子带来的潜在负作用^［5］。因此研究者对组织特异型启动子的研究和应用越来越重视。

提高光合作用效率是提高作物产量和生物量的有效途径之一^［6］。Rubisco是光合碳同化过程中的关键酶，广泛存在于光合器官中，催化RuBP（Ribulose-1，5-bisphosphate）与CO₂的羧化反应，将无机碳固定为有机碳，是提高植物光合作用效率的重要靶标^［7］。Rubisco全酶通常由大亚基（large subunit，LSU）（~52 kD）和小亚基（small subunit，SSU）（~16 kD）组成^［8］。在植物中，大亚基由叶绿体基因rbcL编码，小亚基由核基因rbcS编码^［9］。Rubisco小亚基虽不直接参与形成活性位点，但能够稳定全酶结构，是Rubisco实现催化活性所必需的。

Rubisco小亚基基因主要在绿色光合组织中高表达，因此在基因工程的相关应用中，Rubisco启动子经常作为实现叶片等绿色组织中基因高表达的启动子^［10］。例如：豆科（Fabaceae）植物鹰嘴豆品系（Cicer arietinum）中该启动子在绿色组织中活性较高^［11，用于驱动拟南芥（Arabidopsis thaliana）转基因的更高效表达^［12］；从小麦（Triticum aestivum）中分离的TarbcS启动子片段可驱动基因在绿色组织中特异性高表达^［13］；前人报道过甘薯（Dioscorea esculenta）的IbRbcS1启动子可用于植物遗传转化^［14］，与CaMV 35S pro：：GUS植物中的表达水平相同，该启动子的许多功能在水稻（Oryza sativa）中已得到验证，如光诱导、组织特异性以及高效表达的特性^［15］。

杨树（Populus）是我国重要的经济树种，随着科学技术的进步，已有多种杨树树种完成了全基因组测序^［16-17］。杨树在农田防护林建设、国土绿化等方面有着非常重要的地位，尤其在全球气候变化背景下杨树的固碳效益日益成为国内外关注的焦点^［18］。光合作用是植物获取物质和能量的基础，在植物界甚至全球生态系统能量与物质循环中的作用极为重要^［19］。光合作用从大气中吸收CO₂合成有机物并将其储存在生物体内或土壤中从而起到降低大气CO₂浓度和缓解气候变化的作用^［20］。

杨树中rbcS启动子尚未克隆和应用。本研究通过BLAST在线搜索毛果杨中Rubisco活化酶小亚基家族成员，发现4个成员（分别为Potri.018G09-1401、Potri.006G167901、Potri.017G114600、Potri. 004G100000）。在小黑杨（P.×xiaohei）Rubisco小亚基基因中仅找到Potri.017G114600、Potri.004G10-0000和Potri.018G091401的同源基因，分别命名为PxrbcS1（Potri.017G114600）、PxrbcS2（Potri.004G10-0000）和PxrbcS3（Potri.018G091401）。因此本研究对PxrbcS1、PxrbcS2、PxrbcS3进行RT-PCR分析，选取表达量较高的2个基因，分别为PxrbcS1、PxrbcS2，克隆小黑杨PxrbcS1和PxrbcS2基因上游前 2 240、2 174 bp的启动子序列，通过农杆菌（Agrobacterium）介导遗传转化84K杨（P. alba×P. glandulosa）获得转基因植株，结合GUS组织化学染色以及检测该启动子表达部位、表达强度，将其应用到提高植物光合作用的遗传操作中，为采用基因工程手段提高包括杨树在内的植物光合效率提供可选择的启动子资源。

1 材料与方法

1.1　植物材料

小黑杨、84K杨无菌组培苗于温度22 ℃、光周期16h/18 h的温室内培养，分别用于目的基因的克隆以及遗传转化。

1.2　小黑杨Rubisco小亚基基因家族成员表达量分析

使用CTAB法分别提取野生型小黑杨叶片总RNA，反转录成cDNA；将PxUBQ7（Potri.0005G220-60）作为内参基因，利用附表1（见本刊网站）中的引物进行RT-qPCR，采用2^-ΔΔCT法分析定量数据，以上试验均设置3个生物学重复。

1.3　小黑杨Rubisco活化酶小亚基基因PxrbcS1、PxrbcS2启动子生物信息学分析

以小黑杨PxrbcS1、PxrbcS2转录起始位点上游2 000 bp启动子区域利用植物顺式作用元件库（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）进行顺式作用元件预测和分析。

1.4　小黑杨PxrbcS1、PxrbcS2启动子的克隆

利用DNA提取试剂盒（北京擎科生化科技有限公司）提取小黑杨的总DNA。根据已有的 PxrbcS1、PxrbcS2基因位点上游前2 240、2 174 bp序列（小黑杨Rubisco小亚基基因序列由东北林业大学国家重点实验室提供），设计5′端及3′端特异引物，引物序列见表1。扩增PxrbcS1、PxrbcS2基因启动子编码区。根据附表1中的引物进行目的片段扩增，反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 15 s，共35个循环；72 ℃再延伸7 min，PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。凝胶回收试剂盒（北京擎科生物科技股份有限公司）回收目的片段，并连入Zero TOPO-Blunt载体中，转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α感受态，对获得的单克隆进行菌落PCR验证，筛选后的阳性克隆质粒分别命名为PxrbcS1、PxrbcS2，送至哈尔滨生工生物技术有限公司测序。克隆序列见本刊网站电子附件。

1.5　构建植物表达载体及遗传转化

1.5.1　构建植物表达载体

通过附表1引物扩增的目的片段，利用ClaⅠ、BamHⅠ分别对PBI121-GUS载体和PxrbcS1、PxrbcS2质粒进行双酶切，并分别回收目的片段，利用T4 DNA ligase过夜连接转化大肠杆菌DH5α感受态，对获得的单克隆进行菌落PCR验证，筛选后的阳性克隆命名为pBI121-pPxrbcS1：：GUS、pBI121-pPxrbcS2：：GUS，送至哈尔滨生工生物技术有限公司测序。选取测序正确的质粒转化至农杆菌GV3101，验证元件保存菌种。

1.5.2　遗传转化转基因植株的获得及阳性植株检测

将在-80 ℃冰箱保存的pBI121-pPxrbcS1：：GUS、pBI121-pPxrbcS2：：GUS农杆菌取出，在含有卡那（Kan）和利福平（Rif）抗性的固体LB培养基上三级划线，28 ℃恒温培养48 h后，选择大小适中的单菌落，接种到10 mL含有Kan和Rif抗性的液体LB培养基中，28 ℃、200 r·min^-1恒温培养至OD₆₀₀达到1.0左右，从中吸出1 mL加到25 mL含Kan、Rif的LB液体培养基中震荡扩繁，测得OD₆₀₀值为0.5~0.6，4 ℃、4 000 r·min^-1离心10 min，弃上清液，用加入AS（50 mg·L^-1）的1/3MS重悬液，使OD₆₀₀达到0.6~0.8，用于遗传转化；取无菌且长势旺盛的84K杨组培苗，剪下第2~4片完全展开叶，每片叶片剪去叶尖，并修剪其边缘后将其浸泡在OD₆₀₀达到0.6~0.8的1/3MS重悬液中，28 ℃、100 r·min^-1振荡培养30 min；将重悬液中浸泡的叶片取出，用无菌纸吸干叶表面残余的重悬液，叶背向下平铺在共培养培养基上，轻轻按压叶片，使叶片完全接触到培养基上，（22±2） ℃暗培养48 h；将叶片从共培养培养基转移至筛选分化培养基上；分化培养30~40 d后，将筛选分化培养基中大小适合的抗性芽转移至筛选生根培养基中，待抗性芽长至2~3 cm时，将其剪下再次插入筛选生根培养基中，1~2周长出不定根，即为抗性植株。

1.5.3　84K杨阳性植株检测

以野生型、转基因84K杨组培苗叶片DNA为模板，用附表1中的引物进行PCR扩增，反应体系如下：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，共35个循环；72 ℃再延伸 4 min，4 ℃保存。

1.6　转基因84K杨GUS活性检测及表达量分析

1.6.1　转基因84K杨GUS染色

将上述转基因84K杨整株浸入GUS染液 （10 mmol·L^-1 EDTA、100 mmol·L^-1 Na₃PO₄、2 mmol·L^-1铁氰化钾、2 mmol·L^-1亚铁氰化钾、0.1% TritonX-100、1 mmol·L^-1 X-Gluc调pH为7.0）中，盖上盖 子并留下气孔，放到干燥器中抽真空，达到最低气压时，关闭抽气泵，同时关闭干燥器阀，保持负压 15 min，放气3次以上，直到组织沉到瓶底为止。盖紧瓶盖，37 ℃恒温箱中避光放置8 h，将组织 移入固定液（无水乙醇）中，当固定液颜色变深 时更换固定液，直到样品颜色变为白色为止。待其脱色完成，将它们移入透明液（水、甘油、乳酸、苯酚按1∶1∶1∶2的体积比混合配制）中，透明处 理，直到样品透明为止。观察并将样品保存在无水乙醇中。

1.6.2　小黑杨 Rubisco活化酶小亚基基因PxrbcS1、PxrbcS2启动子活性分析

测定转基因植株的GUS基因表达量，使用CTAB法分别提取转基因84K杨根、茎、叶总RNA，反转录成cDNA，以其为模板，以PxUBQ7作为内参基因，利用附表1中的引物进行RT-qPCR，采用2^-ΔΔCT法分析定量数据，并使用Excel 2010、SPSS 8.5和GraphPad Prism 8软件进行柱形图绘制和差异显著性分析。以上试验均设置3个生物学重复。

2 结果与分析

2.1　小黑杨Rubisco小亚基基因表达量分析

对小黑杨中3个Rubisco活化酶小亚基基因在叶片中的表达量进行分析，选取其中2个表达量较高的基因启动子进行克隆。结果表明，叶中PxrbcS1、PxrbcS2表达量较高（见图1）。

2.2　小黑杨PxrbcS1、PxrbcS2启动子顺式作用元件分析

利用Plant CARE数据库分析PxrbcS1（2 240 bp）、PxrbcS2（2 174 bp）基因启动子序列顺式作用元件。结果表明，二者均具有多个光响应相关元件，其中包括G-box、Box 4、TCT-motif；参与植物激素反应的元件，如ABRE（参与脱落酸反应）、TCA-element（参与水杨酸反应）。除上述相关顺式作用元件外，PxrbcS2还含有参与光响应的MYB转录因子结合位点MRE和光响应元件ATC-motif（见图2， 表1）。由此推测，PxrbcS1、PxrbcS2启动子在表达过程中除了受到光的调控，还可能参与植物激素反应，在植物生长发育过程中可能具有多种生物学功能。

2.3　小黑杨PxrbcS1、PxrbcS2启动子的克隆

通过上述基因表达分析，利用特异性引物（附表1）通过PCR的方式从小黑杨叶片DNA中扩增出长度为2 240、2 174 bp的片段（见图3），目的片段胶回收后连接Zero TOPO-Blunt载体，转化大肠杆菌DH5α感受态。各随机选取4个单克隆菌落进行PCR检测，菌液送哈尔滨市生工生物工程公司测序，结果表明插入的片段未发生碱基突变，成功克隆得到小黑杨PxrbcS1、PxrbcS2启动子（序列见本刊网站电子附件）。

2.4　pBI121-pPxrbcS1：：GUS，pBI121-pPxrbcS2：：GUS载体构建

测序后，提取Zero TOPO-Blunt-PxrbcS1和Zero TOPO-Blunt-PxrbcS2质粒及pBI121载体质粒，通过酶切连接，将rbcS1、rbcS2连接到pBI121载体质粒中，转化大肠杆菌后提取质粒，PCR鉴定（见图4）后测序，结果表明，插入片段正确，未发生碱基突变。将载体命名为pBI121-pPxrbcS1：：GUS和pBI121-pPxrbcS2：：GUS（见图5）。随后，将构建成功的表达载体转化农杆菌感受态GV3101，挑取单克隆进行PCR检测，阳性克隆菌株备用。

2.5　转基因84K杨的获得及GUS活性分析

2.5.1　获得转基因84K杨阳性植株

农杆菌介导法转化84K杨，经过30 mg·L^-1卡纳筛选，在筛选分化培养基上筛选30~40 d获得抗性芽，将抗性芽转移至筛选抽茎培养基中，待抗性芽长至2~3 cm，剪下转移至筛选生根培养基中，最后将生根的抗性芽转移至不含抗性的正常生根培养基中。使用含GUS基因序列引物对转基因植株进行PCR扩增，筛选获得转基因阳性植株（见图6）。

2.5.2　转基因84K杨的GUS染色

对转基因84K杨进行GUS染色并观察其表达特征。结果如图7~8所示，发现PxrbcS1、PxrbcS2启动子驱动的GUS基因在84K杨叶片中表达，表达产物β-葡萄糖苷酸酶具有显著活性。在茎和根中虽然有所表达，但活性较低。而在野生型84K杨中，并没有检测到GUS基因表达产物活性（见图7）。对转基因84K杨中GUS基因表达做定量分析（见图8），结果表明，转基因84K杨中GUS基因在植株根、茎、叶中均有表达，不同组织中的表达水平存在显著差异（P<0.05），叶中GUS表达量最高，与上述染色结果基本一致，说明PxrbcS1、PxrbcS2启动子可以在84K杨中驱动GUS基因表达，并且PxrbcS1、PxrbcS2启动子主要在杨树叶中发挥作用。

3 讨论

Rubisco是叶片可溶性蛋白的主要物质，占50%以上，主要存在于叶绿体基质中^［21］。Rubisco可以固定空气中的CO₂，其活化程度在光合效率最大时可达100%^［22］。有研究^［23］表明，在野生稻中，Rubisco的活力和含量与净光合速率呈正相关关系。Rubisco具有光诱导高效表达的特性，利用这一特性，可以更好地研究光合、光呼吸代谢基因功能。胥华伟等^［24］从水稻基因组DNA中扩增rbcS基因启动子片段构建光诱导表达载体；刘晓庆等^［25］克隆的含有大豆（Glycine max）rbcS基因的SRS4启动子具有一定的光诱导性。本研究从小黑杨基因组中鉴定出编码Rubisco小亚基基因PxrbcS1、PxrbcS2，并在小黑杨中进行了组织特异性表达分析，结果表明，PxrbcS1、PxrbcS2在小黑杨的叶和茎中均有表达，叶的表达量显著高于其他部位。启动子中的顺式作用元件对基因表达调控具有重要作用。克隆的小黑杨PxrbcS1、PxrbcS2启动子序列，通过在线软件分析，发现具有TATA-box和CAAT-box的核心元件，表明所克隆序列具有启动子的典型特征。

对克隆得到的启动子序列进一步分析发现，除了具有典型的核心元件之外，还具有许多与基因功能相关的元件，如G-box、Box 4、TCT-motif多个光响应相关元件。一些相似基因的启动子含有许多相同的顺式作用元件，在棉花（Gossypium hirsutum）GhRCA1启动子的研究中发现，其含有许多光应答元件（如ACE、BoxⅠ、BoxⅡ、G-box、I-box、GT1），可以调节GhRCA1基因表达，本研究也得到了类似的结果。此外还发现了与参与植物激素反应的元件，如ABRE（参与脱落酸反应）、TCA-element（参与水杨酸反应）。这些结果预示PxrbcS1、PxrbcS2除了参与植物光合作用外，可能还与植物体内激素代谢相关。通过分析PxrbcS1、PxrbcS2启动子顺式作用元件，发现该基因可能在植物生长发育中有着重要作用。

驱动GUS基因转化84K杨结果表明，PxrbcS1、PxrbcS2启动子可以驱动GUS基因在84K杨叶片和茎中表达，其中荧光定量PCR分析表明，叶中GUS基因表达量显著高于茎中。同时GUS染色也证明叶片染色程度明显强于茎，而根几乎没有被染色。上述研究表明，PxrbcS1、PxrbcS2启动子序列中有典型的启动子序列特征，并且可以驱动GUS基因表达，具有启动子活性和叶片组织特异性。

综上所述，本研究利用PCR技术克隆了小黑杨PxrbcS1、PxrbcS2基因启动子。根据PxrbcS1、PxrbcS2启动子在片叶中具有高表达活性的特点，可以将其应用到提高植物光合效率以及分析叶片组织中特定基因功能的遗传转化，提供特异性启动子。

参考文献

[1] 周晓红，陈晓光，张晓东，等.番茄果实特异性E8启动子的基因克隆与序列分析［J］.第一军医大学学报，2003，23（1）：25-28.

[2] ZHOU X H， CHEN X G， ZHANG X D，et al.Gene cloning and sequence analysis of tomato fruit-specific E8 promoter［J］.Journal of First Military Medical University，2003，23（1）：25-28.

[3] 尹吴，孙伟博，周燕，等.毛果杨Rubisco活化酶基因的克隆与功能分析［J］.林业科学，2017，53（4）：83-95.

[4] YIN W， SUN W B， ZHOU Y，et al.Cloning and functional analysis of Rubisco activating enzyme gene from Populus tomentosa ［J］.Scientia Silvae Sinicae，2017，53（4）：83-95.

[5] 陈建琦，赵明珠，王义，等.植物中组织特异性启动子的研究进展［J］.北方园艺，2023（19）：128-134.

[6] CHEN J Q， ZHAO M Z， WANG Y，et al.Research progress of tissue-specific promoters in plants［J］.Northern Horticulture，2023（19）：128-134.

[7] 刘聚波，张玉娟，陈洁，等.棉花GhRCA1基因启动子的克隆及序列分析［J］.分子植物育种，2014，12（4）：701-711.

[8] LIU J B， ZHANG Y J， CHEN J，et al.Cloning and sequence analysis of cotton GhRCA1 gene promoter［J］.Molecular Plant Breeding，2014，12（4）：701-711.

[9] KUDO N， MANO K， SUGANAMI M，et al.Effects of overexpression of the Rubisco small subunit gene under the control of the Rubisco activase promoter on Rubisco contents of rice leaves at different positions［J］.Soil Science and Plant Nutrition，2020，66（4）：569-578.

[10] UCHIDA N， FUKAYAMA H， KOSHIMURA H，et al.Effects of nitrogen nutrition and light intensity on Rubisco activase content and photosynthesis in rice leaf［M］//MATHIS P.Photosynthesis：from light to biosphere.Netherlands：Kluwer Academic Press，1995：4579-4582.

[11] 李立人.核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶的结构，调节及遗传工程前景［J］.生命科学，1989，1（1）：12-15.

[12] LI L R.Structure，regulation and genetic engineering prospect of ribulose 1，5-diphosphate carboxylase/oxygenase ［J］.Chinese Bulletin of Life Sciences，1989，1（1）：12-15.

[13] FUKAYAMA H， UEGUCHI C， NISHIKAWA K，et al.Overexpression of Rubisco activase decreases the photosynthetic CO₂ assimilation rate by reducing Rubisco content in rice leaves［J］.Plant & Cell Physiology，2012，53（6）：976-986.

[14] 周昱婕，李霞，陈根云，等.植物RuBisCO研究进展［J］.中国科学：生命科学，2023，53（9）：1213-1229.

[15] ZHOU Y J， LI X， CHEN G Y，et al.Research progress of plant RuBisCO［J］.Scientia Sinica（Vitae），2023，53（9）：1213-1229.

[16] BORUAH R R， KONWAR T， NATH P K，et al.Activity of Arabidopsis Rubisco small subunit promoter in various tissues of chickpea［J］.3 Biotech，2023，13（3）：89.

[17] FU C X， XIAO Z H， GAO F，et al.Proteomics analysis of Ammopiptanthus mongolicus leaves under drought stress［J］.Biotechnology Bulletin，2017，33（6）：69.

[18] 习雨琳，周朋，宋梅芳，等.拟南芥RBCS-1A基因受光调节表达模式及其启动子遗传转化应用评价［J］.作物学报，2012，38（9）：1561-1569.

[19] XI Y L， ZHOU P， SONG M F，et al.Expression pattern of Arabidopsis RBCS-1A gene regulated by light and application evaluation of genetic transformation of its promoter［J］.Acta Agronomica Sinica，2012，38（9）：1561-1569.

[20] MUKHERJEE S， STASOLLA C， BRÛLÉ-BABEL A，et al.Isolation and characterization of rubisco small subunit gene promoter from common wheat（Triticum aestivum L.）［J］.Plant Signaling & Behavior，2015，10（2）：e989033.

[21] TANABE N， TAMOI M， SHIGEOKA S.The sweet potato RbcS gene（IbRbcS1） promoter confers high-level and green tissue-specific expression of the GUS reporter gene in transgenic Arabidopsis ［J］.Gene，2015，567（2）：244-250.

[22] 蒋德安，陆庆，翁晓燕，等.水稻光合关键酶类在光合日变化中的作用［J］.作物学报，2001，27（3）：301-307.

[23] JIANG D A， LU Q， WENG X Y，et al.The role of key enzymes in rice photosynthesis in diurnal variation of photosynthesis［J］.Acta Agronomica Sinica，2001，27（3）：301-307.

[24] 刘文国，张旭东，黄玲玲，等.我国杨树生理生态研究进展［J］.世界林业研究，2010，23（1）：50-55.

[25] LIU W G， ZHANG X D， HUANG L L，et al.Research progress of poplar physiology and ecology in China［J］.World Forestry Research，2010，23（1）：50-55.

[26] 张红娇，张双，胡志宝，等.毛果杨PtSUT基因的全基因组鉴定及表达分析［J/OL］.分子植物育种，1-9.［2024-04-02］.

[27] ZHANG H J， ZHANG S， HU Z B，et al.Genome-wide identification and expression analysis of PtSUT gene in Populus tomentosa ［J/OL］.Molecular Plant Breeding，1-9.［2024-04-02］.

[28] 贾黎明，刘诗琦，祝令辉，等.我国杨树林的碳储量和碳密度［J］.南京林业大学学报（自然科学版），2013，37（2）：1-7.

[29] JIA L M， LIU S Q， ZHU L H，et al.Carbon storage and carbon density in Yang Shulin［J］.Journal of Nanjing Forestry University（Natural Science Edition），2013，37（2）：1-7.

[30] 肖璞，刘虎虎，王翀，等.植物高光效研究进展［J］.生物学杂志，2020，37（2）：88-91.

[31] XIAO P， LIU H H， WANG C，et al.Research progress on high photosynthetic efficiency of plants［J］.Journal of Biology，2020，37（2）：88-91.

[32] 盛阳阳，徐秀美，张巧红，等.光合作用碳同化的合成生物学研究进展［J］.合成生物学，2022，3（5）：870-883.

[33] SHENG Y Y， XU X M， ZHANG Q H，et al.Progress in synthetic biology of carbon assimilation in photosynthesis［J］.Synthetic Biology Journal，2022，3（5）：870-883.

[34] 胥华伟，侯典云.番茄 Rubisco小亚基叶绿体转运肽的克隆及其功能验证［J］.基因组学与应用生物学，2018，37（4）：1570-1575.

[35] XU H W， HOU D Y.Cloning and functional verification of chloroplast transporter peptide from tomato Rubisco subunit［J］.Genomics and Applied Biology，2018，37（4）：1570-1575.

[36] 崔喜艳，董雅致，刘晓庆，等.栽培大豆Rubisco小亚基基因（rbcS）全长cDNA的克隆及原核表达［J］.中国油料作物学报，2014，36（3）：329-333.

[37] CUI X Y， DONG Y Z， LIU X Q，et al.Cloning and prokaryotic expression of full-length cDNA of Rubisco small subunit gene（rbcS） in cultivated soybean［J］.Chinese Journal of Oil Crop Sciences，2014，36（3）：329-333.

[38] 冯钰娇.水稻Rubisco活化酶（OsRCA）基因过表达对玉米Rubisco活化状态及光合特性的影响［D］.扬州：扬州大学，2023.

[39] FENG Y J.Effects of rice Rubisco activating enzyme（OsRCA） gene overexpression on Rubisco activation and photosynthetic characteristics of maize［D］.Yangzhou：Yangzhou University，2023.

[40] 胥华伟，史国安，范丙友，等.水稻Rubisco小亚基启动子的克隆及光诱导表达载体的构建［J］.基因组学与应用生物学，2012，31（5）：455-459.

[41] XU H W， SHI G A， FAN B Y，et al.Cloning of Rubisco small subunit promoter in rice and construction of light-induced expression vector［J］.Genomics and Applied Biology，2012，31（5）：455-459.

[42] 刘晓庆.大豆RuBP羧化酶小亚基基因（rbcS）启动子的克隆及功能鉴定［D］.长春：吉林农业大学，2011.

[43] LIU X Q.Cloning and functional identification of small subunit gene（rbcS） promoter of soybean RuBP carboxylase［D］.Changchun：Jilin Agricultural University，2011.

基金资助

黑龙江省自然科学基金联合引导项目(LH2022C015)