热带睡莲展叶前后叶片形态结构差异与叶脐胎芽发育的关系

Relationship Between the Differences in Leaves Morphology and Structure and Epiphyllous Bud Development of Tropical Water Lily before and after Leaf Expansion

摘要

以热带胎生睡莲‘鲁比’（Nymphaea ‘Ruby’）和‘蓝鸟’（N. ‘Blue Bird’）的胎生与非胎生叶片为材料，非胎生睡莲‘蓝星’（N. ‘Colorata’）叶片为对照（CK），测定并比较3个品种的叶片形态特征参数，并采用石蜡切片技术观察卷叶期和展叶后的叶片解剖结构，旨在探讨热带睡莲叶片形态特征与胎芽发育的关系。结果表明：3个品种均具有典型的热带睡莲特征，‘鲁比’和‘蓝鸟’的胎生叶片除叶脐形成胎芽以外，叶长、叶宽和叶面积略低于非胎生叶片，但差异均不显著（P>0.05），而叶片解剖结构特征参数随着叶片的发育发生了改变。胎生睡莲展叶后叶片上、下表皮以及海绵组织厚度较卷叶期变薄，均高于非胎生叶片，而栅栏组织厚度、栅海比较卷叶期增加，且低于非胎生叶片，说明胎芽的发育导致栅栏组织结构紧密度降低，而海绵组织结构疏松度增加，但与叶片整体厚度无关；非胎生品种‘蓝星’叶片栅海比和细胞结构紧密度均显著高于胎生品种的叶片。各指标的可塑性变异较高，且存在一定的相关关系，具有明显的协同进化趋势。主成分分析显示，上下表皮厚度、海绵组织厚度、栅栏组织厚度、栅海比、叶片组织结构紧密度和疏松度均可视为反映睡莲胎生叶片解剖结构特征的主要指标。因此，胎生叶片通过改变叶肉组织结构的方式来响应胎萌的发生。

Abstract

To explore the relationship between leaf morphological characteristics and epiphyllous bud development of tropical water lilies， the viviparous and non-viviparous leaves of Nymphaea ‘Ruby’and N. ‘Blue Bird’ were used as materials， and the non-viviparous leaf of N. ‘Colorata’ was as control. The leaf morphological parameters of three cultivars were measured and compared， and the leaf anatomical structure during the leaf-rolling stage and leaf-expansion stage was observed using paraffin section. The results showed that all three cultivars had typical characteristics of tropical water lilies， the viviparous leaves of N. ‘Ruby’ and N. ‘Blue Bird’， except for the epiphyllous bud， their leaf length， leaf width， and leaf area were slightly lower than non-viviparous leaves， but there were no significant differences（P>0.05）， while the anatomical structural parameters of the leaves changed with the leaf development. Although the upper and lower epidermis， sponge tissue of the leaves of viviparous N. ‘Ruby’and N. ‘Blue Bird’ were thinner at the leaf-expansion stage， both were higher than that of non-viviparous leaves. However， the palisade tissue and the ratio of palisade to sponge increased at the leaf-expansion stage， and were lower than that of non-viviparous leaves， indicating that the development of the viviparous buds resulted in a decrease in the structural compactness of the palisade tissue， while the looseness of sponge tissue structure increased， but it was not related to the leaf thickness. The ratio of palisade to sponge and cell structure compactness of the non-viviparous variety N. ‘Colorata’ were significantly higher than those of the viviparous variety N. ‘Ruby’. In addition， the plasticity variation of each indicator was relatively high， and there was a certain correlation and an obvious co-evolution. Principal component analysis showed that the thickness of the upper and lower epidermis， spongy tissue， palisade tissue， the ratio of palisade to spongy， and the compactness and looseness of the leaf tissue structure might be regarded as the main indicators to reflect the anatomical structure characteristics of the viviparous leaves of water lilies. Viviparous leaves responded to epiphyllous bud development by changing the structure of mesophyll tissue.

Graphical abstract

关键词

叶胎生 / 表型特征 / 解剖差异 / 可塑性变异

Key words

leaf vivipary / phenotypic characteristics / anatomical differences / plasticity variation

睡莲为睡莲科（Nymphaeaceae）多年生宿根水生植物统称，品种繁多，花色丰富，全世界睡莲属植物共有50多个种（含变种），园艺栽培品种已达 1 000余种，具有较高的观赏性和食用性。花朵可以泡茶、制作切花，全株可入药，含多种生物活性物质^［1-2］，根茎叶对水体污染物和富营养化水体具有超强的净化能力，能有效控制湿地、湖泊水中的Pb²⁺、Cr²⁺、Cd²⁺、Mn²⁺等重金属离子，是构建水体净化群落的重要物种^［3-4］。近年来，关于睡莲的研究主要涉及栽培技术和新品种选育^［5］、耐寒性评价^［6］、种质资源与遗传多样性分析^［7-8］、花色^［9］、花香挥发性成分^［10］、精油提取、抗氧化和细胞毒性活性^［11-13］以及全基因组的鉴定和分子进化分析^［14］等方面。目前睡莲的全基因组测序已经完成，为其后续的功能鉴定分析奠定了基础^［15］。睡莲5个亚属中广热带睡莲亚属（Brachyceras）部分种或品种的叶片具有叶胎生特性。叶片除了进行正常的光合作用以外，叶脐部位还能够形成新的胎芽，并从母体叶片中不断获取营养。胎芽脱离后可快速成苗，且能保持母本的优良性状，短期内可繁育出大量优质且性状稳定的种苗^［16］。这种营养体胎生模式与大多数胎生植物一样，如仙人掌科（Cactaceae）植物^［17］、珠芽蓼（Bistorta vivipara）^［18］等均属于兼性繁殖，能克服种子和分株繁育存在的缺点，更易适应复杂多变的自然环境，是一种重要的繁殖补充途径。

植物叶胎生是一个复杂的过程，受环境、营养条件和遗传因素等共同影响。叶片处于长期的自然选择中，逐渐形成与其功能相适应的外部形态和内部结构，这是物种进化和环境适应的综合表达，其解剖学性状的分析与综合评价是植物系统发育研究的重要依据^［19］，对物种鉴定和品种分类也具有重要意义^［20］。国内外学者通过分析不同植物叶片的解剖结构与生态因子之间的关系，发现高海拔、强紫外辐射下叶片具有角质层变厚，栅栏组织变薄，叶片厚度增加，叶面积增大等特点^［21-22］。面对大气增温、干旱胁迫，叶片解剖结构也会发生相应的调整^［23］。并非所有的热带睡莲都发生胎生现象。对于具有胎生特征的品种（种），随着植株的发育，同一个植株的叶片存在胎生与非胎生现象。胎芽的形成是否导致叶片形态结构的调整尚不明确，目前鲜见相关报道。

本研究以多年生热带胎生睡莲‘鲁比’（N.‘Ruby’）和‘蓝鸟’（N.‘Blue Bird’）为材料，以非胎生睡莲‘蓝星’（N.‘Colorata’）为对照，将3个品种热带睡莲置于相同环境中，比较胎生和非胎生叶片表型差异，通过石蜡切片技术观察不同叶片展叶前后的解剖结构特征并进行相关性分析，探讨叶片胎芽形成和消退的形态解剖差异，为深入研究睡莲胎生机理奠定形态学基础，也为睡莲种质资源良种选育、保护和扩繁提供理论依据。

1 材料与方法

1.1　试验材料

供试材料均以独立大缸栽培的方式种植于西南林业大学温室苗圃基地（25°3′N，102°46′E），基地温度为（25±5） ℃，相对湿度为60%~80%，大缸直径×高为60 cm×50 cm，水深保持在45 cm，室内光照充足，通风良好，全年温差小，进行统一管理。每隔20 d施1次复合肥，N∶P₂O₅∶K₂O质量比为 15∶10∶10，20 g/（株·次^-1），用报纸将肥料包好后插入15 cm深处的泥中，共施3次。根据胎生睡莲植株叶片长势，观察叶片及胎芽发育的表型变化。

1.2　试验方法

1.2.1　取样

2021年8—10月，分别标记长势一致的胎生睡莲‘鲁比’‘蓝鸟’植株，选取同一植株同等大小、处于沉水且呈卷叶期（Ⅰ）的胎生和非胎生叶片（以叶脐部位是否凸起形成白色胎毛为依据）以及展叶期（Ⅱ）浮于水面的胎生和非胎生叶片，同时取同一时期同等大小的热带非胎生睡莲‘蓝星’卷叶期和展叶期的叶片为对照，比较3个品种胎生和非胎生叶片的叶长（LL）、叶宽（LW）、叶面积（LA）、叶裂深度（DD）、叶柄直径（DP）。每种叶片和对照各取10片叶进行比较，3次重复。同时选取近似大小不同品种的睡莲叶片，均在远离主脉部分切成0.5 mm×0.5 mm的方块，每个品种每个时期均取8个样，3次重复，共24个样，立即放入FAA（V（70％乙醇）∶V（甲醛）∶V（乙酸）=18∶1∶1）中固定抽气备用。

1.2.2　叶片解剖结构观察

将固定好的材料用梯度叔丁醇（从50%开始）脱水，石蜡包埋。旋转切片机连续切片（厚7~8 μm），番红-固绿染色，加拿大树胶封片制成永久装片，每个时期挑选8张组织切片，放置在显微镜（凤凰牌PH100-3B41l-IPL）下观察细胞组织，并用二维测量软件DS-3000在每张切片中挑选40倍视野拍照并测量叶片厚度（LT）、上表皮厚度（UE）、栅栏组织厚度（PT）、海绵组织厚度（ST）、下表皮厚度（LE），计算栅海比（P/S）、组织结构紧密度（TST）与组织结构疏松度（TSL）。

叶片解剖指标计算公式：

栅海比=栅栏组织厚度/海绵组织厚度（1）

叶片结构紧密度=（栅栏组织厚度/叶片厚度）×100%（2）

叶片结构疏松度=（海绵组织厚度/叶片厚度）×100%（3）

可塑性指数=（最大值-最小值）/最大值（4）

1.2.3　叶片形态性状测定

当睡莲处于盛花期时，对以上3个不同品种植株的叶片形态特征进行观测比较（见表1），综合评价形态差异。

1.3　数据分析

利用Excel 2010统计数据，采用SPSS 22.0进行单因素方差分析（ANOVA），多重比较采用Duncan新复极差检验（P<0.05）。采用Pearson相关性分析检验叶片各解剖特征的关系。主成分分析采用方差最大化法，以累计贡献率大于85%作为提取主成分的标准。表中的数据为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1　胎生与非胎生睡莲植株形态特征比较

在同等栽培环境条件下，3个热带睡莲品种胎生与非胎生植株叶片均具有典型的热带睡莲特征，叶片边缘呈锯齿状，表型特征差异如图1所示：‘鲁比’的花呈粉色（见图1A），卷叶期和展叶期正面均为绿色（见图1B），叶背呈绿色偏红，开裂角度较大（见图1C~E）；‘蓝鸟’花瓣蓝色（见图1F）， 卷叶期和展叶期叶片背面均分布着不规则的黑色斑点（见图1G），叶形近椭圆形，开裂角度较小（见图1H~J）；‘蓝星’花呈蓝紫色（见图1K），叶近圆形，叶背由绿变淡红色（见图1L~N），叶脉均呈辐射状排列，为变态的掌状叶脉。胎生与非胎生叶片最大的区别在于叶脐处是否凸起，易胎生叶片在卷叶期可见附着胎毛的胎点。结合植株的叶片形态特征参数（见表2），可知胎生品种‘鲁比’和‘蓝鸟’的胎生与非胎生叶片叶长、叶宽、叶面积和叶柄直径之间均无显著差异（P>0.05），说明胎芽的形成对叶片大小影响不大，但2个品种的胎生与非胎生叶片差异均显著高于非胎生‘蓝星’叶片（P<0.05），这可能与品种本身的遗传特性有关。

2.2　不同睡莲叶片解剖结构差异

2.2.1　叶表皮特征

从图2可以看出，3种睡莲叶片横切面的表皮细胞结构基本一致，外壁具角质加厚，均为异面叶，由上表皮、栅栏组织、海绵组织和下表皮组成。上表皮是1层排列紧密且规则的圆形细胞，细胞之间相互连接，而下表皮排列不规则，由2层扁平状细胞构成，细胞间结合也相对比较紧密。从量化参数来看（见图3），胎生睡莲‘鲁比’和‘蓝鸟’的叶片厚度显著高于非胎生睡莲‘蓝星’（P<0.05），展叶后的‘鲁比’胎生和非胎生叶片厚度均变薄，而‘蓝鸟’的叶片厚度增加。从叶片不同发育时期来看，展叶后，‘鲁比’和‘蓝鸟’胎生和非胎生叶片的上、下表皮厚度较卷叶期薄，相反，非胎生睡莲‘蓝星’的叶片上、下表皮厚度随叶片的展开不断增加，尤其是下表皮增幅较大，但3个品种的上表皮厚度均较下表皮薄，但差异不显著（P>0.05）。相较于同一品种的胎生和非胎生叶片，‘鲁比’胎生叶片的上、下表皮较非胎生叶片厚，而‘蓝鸟’胎生叶片则呈相反的趋势。从叶片厚度可以看出，胎芽的形成可能与叶片厚度无关，主要受品种的遗传特性或生境的影响。

2.2.2　叶肉解剖结构特征变化

睡莲叶肉组织明显分化为栅栏组织和海绵组织（见图2），栅栏组织与叶片上表皮呈垂直状，由1层细长的柱形薄壁细胞紧密排列而成，对照显微结构切片着色较深，而发达的海绵组织位于栅栏组织与下表皮之间，由多层形状不规则的薄壁细胞分隔为大小不等的中空腔松散排列组成。从图2中可以看出，胎生睡莲品种中，无论是胎生还是非胎生睡莲叶片，卷叶期和展叶后的栅栏组织和海绵组织变化类似，细胞间隙排列逐渐疏松，空隙变大，而展叶后的非胎生睡莲‘蓝星’叶片的栅栏组织和海绵组织逐渐脱离，变化明显。

结合图3可知，展叶后，3个品种叶片的栅栏组织厚度均增加，其中胎生品种‘蓝鸟’的胎生叶片增幅最大（P<0.05），而非胎生品种‘蓝星’叶片的栅栏组织厚度变化不明显。胎生品种‘鲁比’及非胎生品种‘蓝星’叶片的海绵组织厚度均迅速减小，但仍显著高于栅栏组织1.5~3.0倍（P<0.05），其中非胎生‘蓝星’叶片海绵组织厚度降幅最大，且胎生叶片>非胎生叶片，但3个品种的栅海比均增加。从同一个胎生品种来看，展叶后的胎生叶片栅栏组织比非胎生叶片薄，而海绵组织则比非胎生叶片厚，两者在不同叶片之间均存在显著差异（P<0.05）。此外，展叶后3个品种的栅栏组织结构紧密度均提高，而海绵组织疏松度均降低，其中以非胎生品种‘蓝星’叶片的增幅和降幅最大（P<0.05）。‘鲁比’和‘蓝鸟’胎生叶片的TST均低于非胎生叶片，而2个品种胎生叶片的TSL则高于非胎生叶片，说明胎芽的发生导致叶肉组织结构发生相应变化。

2.3　叶解剖结构的可塑性变异和主成分分析

从表3可以看出，不同睡莲叶片的可塑性指数存在差异性，其中上、下表皮厚度的可塑性指数最高，介于0.35~0.60，而叶片厚度的可塑性指数最小为0.09~0.18，其中非胎生品种‘蓝星’的可塑性指数均高于胎生睡莲。从胎生与非胎生叶片来看，胎生叶片的可塑性指数均低于非胎生叶片，说明叶片胎萌的发生除了受遗传因素影响外，可能受特定环境条件的限制。整体来看，变异系数均小于50%，属于弱变异，说明各品种叶片在形态上变异不大。主成分分析显示了3个主要的性状变异轴（见图4），前2个累计解释率为75.26%，其中，第一轴解释总变异的59.63%，主要由叶片形态指标叶长、叶宽、叶面积以及表征植物防御功能的指标叶肉组织结构决定；第二轴解释总变异的15.63%，主要由表征叶片形态指标的下表皮厚度决定。

2.4　睡莲叶片性状与解剖结构的RDA分析

由睡莲胎生和非胎生叶片的形态结构特征相关性分析结果可知（图5），无论是胎生还是非胎生叶片，叶长、叶宽和叶面积之间均呈极显著正相关（P<0.01）。对于胎生叶片（见图5A），叶片表型性状均与叶片厚度、栅栏组织厚度和海绵组织厚度呈极显著正相关（P<0.01），栅海比与栅栏组织、海绵组织、细胞结构紧密度之间呈极显著正相关（P<0.01）。对于非胎生叶片（见图5B），叶裂深度与叶片形态呈极显著正相关（P<0.01），叶肉组织之间均呈显著或极显著正相关。

3 讨论

睡莲根据生态习性分为热带睡莲和耐寒睡莲，热带睡莲中仅有部分品种具有叶胎生特性，叶片在胎生过程中不同部位合成的碳水化合物等营养物质减少，并在叶脐部位积累，促进了胎芽发育^［24］，但在长期的形态观察中发现，随着母体植株无性繁殖年限的延长，叶片上的胎芽长势减弱甚至胎点消失，即同一胎生品种的胎生和非胎生叶片共存，这可能与植株的生理代谢水平有关。展叶前后睡莲叶色也会发生相应改变，这与金叶连翘（Forsythia koreana‘Sun Gold’）叶片成熟过程中的颜色变化类似，与其横切面解剖结构特征无关^［25］，但叶脐形成胎芽过程所需的营养物质主要来源于叶片，促使胎生叶片枯黄衰老的时间较非胎生叶片提前^［24］，进而导致叶片在解剖结构上做出相应调整。因此，叶片形态与解剖结构变化是植物适应环境的重要机制^［4，26］，叶片形状、大小、厚度、上下表皮细胞及其附属物、栅栏组织、海绵组织、气孔密度等一系列指标除了受植物自身遗传因素、营养物质转移等多因子控制外，还与植物的光合速率、抗性强弱等密切联系。

植物叶片有较厚的上表皮和下表皮细胞和角质层，可增强不透水性，防止植物体细胞内水分过度蒸腾，还具有机械支撑作用，可防寒保温，具备耐热、保水及耐旱能力^［27-28］，较厚的叶片表皮还能防御病菌侵染^［29］。本研究中，热带睡莲无论胎生与否，展叶后的叶片上、下表皮厚度均变薄，下表皮厚度均大于上表皮，这与卫沙沙等^［30］的研究结果一致，且幼态叶沉水时，上、下表面均不具备气孔，成熟叶浮于水面，气孔只分布在上表皮，这可能与植株长期适应水生生境有关。此外，不同品种（种）叶片叶肉组织细胞排列各不相同^［31］，有些植物叶片为异面叶，甚至呈“双栅栏型”结构^［32］，而有些属于等面叶^［33］。栅栏组织和海绵组织的分化程度是植物长期适应环境的结果。睡莲叶片海绵组织中的气腔在卷叶期已形成，但排列相对紧密，这可能是由于水下缺少阳光和氧气以及环境较稳定。展叶后，海绵组织空隙增大，细胞排列逐渐稀疏。这种高度发达且分隔的气腔结构体现了睡莲对环境的适应性，有助于睡莲叶片在水生环境中储存较多的氧气，使得氧气能够从叶片上表皮气孔运输到根部^［34］。

叶片结构中变异最大的是叶肉，也是进行光合作用的主要部位。红树植物叶片栅栏组织和海绵组织厚度均与光合速率呈正相关关系，尤其与海绵组织厚度的相关性更强，说明叶肉组织厚度变化对光合作用有显著影响^［35］。栅海比反映栅栏组织的发育程度，比值越大，栅栏组织越发达，光能利用率也就越高^［36］。陈燕等^［37］比较了5种适应海岸潮间带生境的红树植物叶片结构，结果发现叶片抗寒性与栅海比、紧密度呈正相关，与疏松度呈负相关，许少祺等^［28］对不同豌豆（Vicia）的研究也得到类似的结果。本研究中不同睡莲的叶片厚度、栅栏组织、海绵组织厚度等解剖结构指标在展叶后均表现出不同程度的改变，海绵组织厚度大于栅栏组织，这与杨宽^［38］的研究结果一致。所不同的是，胎生品种展叶后的栅栏组织厚度小于非胎生叶片，而海绵组织厚度大于非胎生叶片。从栅海比和紧密度来看，胎生叶片低于非胎生叶片，说明胎芽的发生降低了叶片结构的紧密度。在叶脐部位，新生胎苗的形成使得叶片质地更加疏松，这可以解释胎生叶片黄化腐烂的时间较非胎生叶片提前。此外，睡莲叶片解剖指标之间均存在相关关系，部分指标呈极显著相关性，说明叶片组织结构之间存在着协同进化趋势，这种协同性进一步表明叶片形态结构是睡莲对水体环境变化的一种非常重要的适应策略。

植物叶片作为与环境接触面积最大的器官，具有根据不同环境调整表型特征的能力，这种差异可能来自表型可塑性^［39］，会引起光合作用等生理功能发生相应变化^［35］；也可能与种源地形成的遗传变异有关^［40］。睡莲之所以能够很好地适应水生环境，归因于漂浮叶和沉水叶片结构的差异性，以及较强的可塑性。Catian和Scremin-Dias^［34］比较了睡莲沉水叶和浮叶的表型变化，表明该物种会根据环境中的物理变化调整叶片发育，甚至可能调整叶片胎生的繁殖策略。Vasyl等^［41］对睡莲浮叶解剖结构和叶绿体超微结构进行研究，结果证实其对水体富营养化的高耐受性，发达的海绵组织和叶绿体超微结构对强光的有效感知，可以进行充足的气体交换，能够更好地适应高光照环境。本研究中，胎生睡莲和非胎生睡莲均为异面叶，生境相似，但胎生叶片的可塑性指数均低于非胎生叶片，说明叶片胎萌的发生导致叶片形态结构上的差异可能与遗传因子有关。此外，非胎生叶片长宽、叶面积之间以及叶肉组织解剖结构特征之间均呈显著相关性，表明叶片的胎生与否可能受叶片不同组织的调控。结合主成分分析结果，以及睡莲叶片长宽、上下表皮、海绵组织、栅栏组织、栅海比、叶片组织结构紧密度和疏松度等在生物体中的特性可知，叶片解剖结构特征除了表现出对特定环境的响应外，也有利于区别胎生与非胎生叶片的差异。研究发现叶片胎生比例也会随着不同环境而改变，但叶片胎萌是表型结构调整的产物还是生理功能发生相应变化的结果尚未得到充分论证。此外，这一过程还受营养条件、植株年龄、激素以及基因调控的影响。因此，对于睡莲叶片胎生发育过程中的结构变化与各因素之间的关系有待进一步研究。

4 结论

睡莲叶片胎萌的发生对表型特征影响不大，但会导致解剖结构发生改变，同属热带睡莲，3个品种的叶片横切面结构组成相同，但组织厚度及比值存在差异性。展叶后‘鲁比’胎生叶片厚度大于非胎生叶片，‘蓝鸟’则相反，说明胎芽的形成可能与叶片厚度无关；两者的上、下表皮厚度以及海绵组织厚度均高于非胎生叶片，栅栏组织厚度、栅海比均低于非胎生叶片；随着胎芽的发育，展叶后叶片栅栏组织结构紧密度降低，海绵组织结构疏松度较高，非胎生品种‘蓝星’叶片栅海比和细胞结构紧密度均显著高于胎生品种的胎生与非胎生叶片，说明胎生叶片可以通过改变表皮、栅栏组织、海绵组织厚度等响应胎萌的发生。

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基金资助

云南省科技厅农业联合专项面上项目(202301BD070001-119)

云南省教育厅一般项目和研究生项目(2021Y254)