多花黄精大小孢子发生及雌雄配子体发育

Sporogenesis and Gametogenesis of Polygonatum cyrtonema

摘要

利用石蜡切片技术对多花黄精（Polygonatum cyrtonema）不同发育时期的花芽切片，探究多花黄精大小孢子发生及雌雄配子体发育特征，为多花黄精遗传育种提供基础资料。结果显示：（1）多花黄精花药壁由表皮、药室内壁、中层和绒毡层各1层细胞构成，绒毡层为分泌型，成熟药室内壁具纤维性加厚，成熟绒毡层细胞含二核或多核结构；（2）小孢子母细胞减数分裂过程中胞质经连续型分裂形成左右对称的四分体，成熟花粉粒多为二细胞型，偶见三细胞型；（3）多花黄精大孢子母细胞经减数分裂后形成直线排列的四分体，胚囊发育类型为蓼型。多花黄精生殖细胞的发育特征与黄精属其他植物具有相似性，分泌型的绒毡层和三细胞型花粉粒的存在说明多花黄精具有更为进化的发育特征。

Abstract

The floral bud development of Polygonatum cyrtonema was examined at various stages using paraffin sectioning techniques， the characteristics of megasporogenesis and microsporogenesis and the development process of male and female gametophytes were explored respectively， the fundamental data for the genetic improvement and breeding of P. cyrtonema was provided.The results showed that： （1）The anther wall was composed of epidermis， endothecium， middle layer and tapetum layer. The tapetum layer was secretory， with mature tapetal cells exhibiting binucleate or multinucleate structures. The mature endothecium displayed fibrous thickened. （2）During the meiosis of microspore mother cell， cytokinesis occurred through a continuous type， resulting in tetrads arranged symmetrically in a linear pattern. Most mature pollen grains were two-cell type， occasionally three-cell type. （3）Meiosis of the megaspore mother cell produced a linear tetrad， and the development of the embryo sac followed the Polygonum type. The reproductive cellular development in P. cyrtonema demonstrated similarities to other members of the Polygonatum genus. Notably， the presence of a secretory tapetum and the three-celled pollen grain suggests that P. cyrtonema might have a relatively advanced evolutionary status.

Graphical abstract

关键词

多花黄精 / 大小孢子发生 / 雌雄配子体

Key words

Polygonatum cyrtonema / megasporogenesis and microsporogenesis / male and female gametophytes

多花黄精（Polygonatum cyrtonema）为天门冬科（Asparagaceae）黄精属（Polygonatum）多年生草本植物，其主要利用部位为地下根状茎，可作药食两用，含有多糖、甾类化合物和生物碱等多种活性成分^［1］，在脾胃治疗^［2］、机体免疫力提高^［3］和肠屏障功能修复^［4］等方面具有重要作用。

植物生殖生物学是研究植物繁殖器官发育特点和生殖活动规律的一门学科，包括花芽分化、雌雄配子体发育、开花物候特征、传粉机制、受精过程及胚胎发育等部分^［5］，其中，大小孢子发生及雌雄配子体发育为其基础研究内容，是胚胎及种子形成的前提^［6-7］。王金子^［8］以玉簪（Hosta plantaginea）为材料，通过研究玉簪的大小孢子发生及雌雄配子体发育过程，为其他玉簪品种的研究奠定了基础；在龙舌兰属（Agave）的研究中发现，龙舌兰（Agave colimana）大孢子减数分裂过程中的异常行为会直接形成异常胚囊，无法正常受精形成胚胎^［9］；黄精属的玉竹（P. odoratum）^［10］、热河黄精（P. macropodum）、黄精（P. sibiricum）^［11］和湖北黄精（P. zanlanscianense）^［12］等相关研究均从细胞学角度探究了雌、雄蕊性细胞发育的特征及发育过程中存在的问题，不仅为遗传育种奠定了基础，也为深层次的分子研究提供了前提^［13-14］，这些报道为天门冬科植物的生殖生物学及系统分类研究补充了资料。

目前，对多花黄精的研究集中在药理作用^［15］、成分分析^［16］、栽培种植^［17］等方面，多花黄精繁殖器官发育过程的研究欠缺阻碍了其生殖生物学的发展。本研究利用石蜡切片技术，对多花黄精不同发育时期的花芽材料进行切片观察，揭示多花黄精性细胞的发育特征，以完善黄精属生殖发育理论，促进多花黄精遗传育种，对天门冬科植物的系统分类研究有重要意义。

1 材料和方法

试验材料为湖北省五峰土家族自治县（30°9′23.1″N，111°4′9.1″E）不同发育时期的多花黄精花芽，于2023年5月采集并固定于FAA溶液中。材料首先依次经过体积分数逐级递增的乙醇梯度脱水（每级浸泡1 h），再经无水乙醇+二甲苯混合溶液（体积比1∶1）、2次二甲苯溶液各浸泡1 h透明，经浸蜡和石蜡包埋。多花黄精雄蕊纵向放置于包埋底模，雌蕊横向放置于包埋底模，脱模成块，包埋块经LEICARM2245切片机连续切片，切片厚度为8~10 μm。蜡片展开后贴合到载玻片上，置于干燥箱中60 ℃烘干2 h。依照白洁等^［18］的染色方法进行改良，完全干燥后的装片置于纯二甲苯中浸泡10 min，重复3次，用于脱蜡。再依次经过体积分数逐级递减的乙醇浸泡（每级3 min），纯净水浸泡3 min后番红-固绿对染（1%番红染色30 min，0.5%固绿复染30 s），最后再经过3次二甲苯浸泡，树胶封片。晾干装片，1个月后在Olympus BH2显微镜下观察、拍照。

2 结果与分析

2.1　花药壁发育

在发育初期，花药壁仅有1层原表皮，初生壁细胞由孢原细胞分化而来，再经多次分裂后形成3层壁细胞，与最外层的原表皮共同组成早期花药壁。在造孢细胞时期，花药壁各结构逐渐发育完全，由外向内依次为表皮、药室内壁、中层和绒毡层，此时绒毡层内细胞为单核（图1A）。小孢子母细胞时期的花药壁会进一步发育，此时单核结构的绒毡层细胞会发生特化，细胞核再次进行分裂，形成二核或多核结构（图1B）。小孢子母细胞形成二分体后，中层细胞开始解体（图1C）。随着发育的进行，在单核小孢子时期的中层细胞完全解体，只留有表皮、药室内壁及绒毡层3层壁细胞，且此时期的绒毡层也开始在原位解体。多花黄精绒毡层的发育类型为分泌型绒毡层（图1D）。绒毡层的解体为小孢子的发育提供营养物质，药室内壁后期向内径扩展，出现带状不均匀加厚现象，最终形成纤维层（图1E）。花粉粒发育成熟后，中层和绒毡层细胞慢慢消失退化，只留下纤维层和表皮细胞，此类细胞失水导致花药壁不均匀收缩，花药开裂，使成熟花粉粒从裂口处散出（图1F）。

2.2　小孢子发生及雄配子体发育

雄蕊原基来源于茎端分生组织，单层表皮细胞内分化出孢原细胞，其分裂形成外层的初生周缘细胞和内层的初生造孢细胞。初生造孢细胞进一步发育为多边形、排列紧密的次生造孢细胞（图2A）。随着发育的进行，多边形的次生造孢细胞变圆、体积变大，彼此分散，出现明显的细胞核，发育成小孢子母细胞（图2B）。小孢子母细胞经过第一次和第二次减数分裂，依次形成二分体、四分体，四分体的4个细胞含有相同遗传物质（图2C），该过程的2次减数分裂均伴随有细胞质的分裂，故多花黄精胞质分裂类型为连续型。

四分体的分隔壁被酶解体，单核小孢子被释放，囊腔中的生殖细胞数量变多（图2D）。小孢子吸收营养逐渐饱满，体积变大，细胞质中央形成1个大液泡，细胞核从中央向细胞壁移动。靠近花粉壁的细胞核经有丝分裂形成营养细胞和生殖细胞（图2E）。最后，生殖细胞脱离花粉壁，形态由梭形变饱满，游离在花粉粒中，即小孢子发育成熟，为成熟花粉粒（图2F）。

2.3　大孢子发生及雌配子体发育

在胚珠发育早期，珠心表皮下分化1个孢原细胞，直接发育成体积大、细胞质浓厚、细胞核明显的大孢子母细胞（图3A）。大孢子母细胞连续2次纵向减数分裂后，形成直线排列的4个大孢子，与合点端和珠孔端连线平行，为四分体。其中，靠近合点端的1个大孢子具有分化成功能大孢子的潜能，其他3个大孢子逐渐退化、消失。之后进入雌配子体发育阶段（图3B），胚珠囊腔逐渐扩大，功能大孢子体积也增大，发育成单核胚囊（图3C）。单核发生有丝分裂形成2个核，2个核分别移向胚囊的合点端和珠孔端，发育成二核胚囊（图3D）。两端的核再进行第二次有丝分裂形成4个核，此时期为四核胚囊（图3E~3F）。最后4个核第三次有丝分裂形成8个核，最终形成八核胚囊，合点端和珠孔端各有4个核（图3G）。胚囊发育成熟时，上下两端各有1个核向胚囊中央移动，来自合点端的为上极核，来自珠孔端的为下极核。合点端的剩余3个核发育成反足细胞，珠孔端的3个核发育成含有1个卵细胞和2个助细胞的卵器（图3H~3I）。多花黄精的胚囊发育类型为蓼型。

3 讨论

花药壁中绒毡层的发育类型可以作为植物系统分类和进化的研究依据^［19］。绒毡层主要分为两类：一类是腺质绒毡层，也称分泌绒毡层，此类型细胞在原细胞位置降解；另一类是变形绒毡层，也称周缘质团绒毡层，此类型细胞原生质团首先移到花粉囊腔，围绕在小孢子或花粉粒周围再降解^［20］。绒毡层可以为小孢子提供营养和原料物质，促进小孢子发育，绒毡层发育不良时会造成雄性不育^［21］。被子植物门中双子叶植物大多属于分泌型绒毡层，单子叶植物部分经济作物为分泌型^［22］。天门冬科属于单子叶植物，多花黄精绒毡层在早期次生造孢细胞时期为单核结构，小孢子母细胞时期细胞特化，形成二核或多核结构，当四分体解体，小孢子被释放进入单核小孢子发育时期，绒毡层细胞于原位置解体，符合分泌型绒毡层细胞的发育规律。多花黄精绒毡层发育类型补充了单子叶植物中绒毡层为分泌型类型的植物范围。王瑞等^［19］通过对多种不同菊科（Asteraceae）植物绒毡层的发育类型研究发现，在向日葵族向菊苣族演化过程中，向日葵族绒毡层的发育由变形型逐渐演化为菊苣族的分泌型绒毡层，分泌型是更为进化的绒毡层发育类型。多花黄精分泌型的绒毡层发育类型说明其花药壁具较进化的发育特征。

同科植物性细胞的发育具有相似性，多花黄精同报道的玉竹、湖北黄精、黄精和热河黄精具有许多相同点^［10-12］，如小孢子母细胞胞质分裂类型为连续型，小孢子四分体为左右对称型，大孢子四分体为直线型，胚囊发育类型为蓼型；但也有不同之处，如湖北黄精和玉竹均为二细胞型^{［10，12］}，多花黄精二细胞型花粉粒和三细胞型花粉粒共存，大部分成熟花粉粒为二细胞型。在植物界中，75%的植物花粉粒发育成熟时为二细胞花粉粒，花粉粒包含1个营养细胞和1个生殖细胞；25%的植物花粉粒发育成熟时为三细胞花粉粒，花粉粒包含1个营养细胞和2个精细胞，大多数植物的单个精细胞会将花粉落到柱头上，花粉管生长时进行第二次有丝分裂，在胚珠中实现卵细胞和中央细胞的双受精^［23］。二细胞花粉粒和三细胞花粉粒精细胞周围的环境是不一样的，二细胞花粉粒精细胞周围是脂质体，三细胞花粉粒精细胞周围是液泡^［24］，并且某些特殊蛋白只能在三细胞花粉粒中表达，以调节植物花粉管的生长^［19］。毛茛科（Ranunculaceae）大多数植物为二细胞花粉粒，在侧金盏（Adonis amurensis）中出现少量三细胞花粉粒的情况，孙颖等^［25］认为此现象并不是导致侧金盏“空籽”的原因。大小孢子发生及雌雄配子体的发育特征对植物分类学具有重要意义^［26］。付琳等^［27］研究含笑属（Michelia）不同物种成熟花粉粒的细胞核数量认为，二细胞花粉粒是较原始的发育特征，三细胞花粉粒较二细胞花粉粒更进化。多花黄精虽然存在2种类型的成熟花粉粒形态，但二细胞型花粉粒偏多，三细胞花粉粒较少，最终是否影响结实，还需进一步探讨。

参考文献

[1] 龙志望.多花黄精的特征特性及林下种植技术［J］.种子科技，2024，42（7）：66-68.

[2] LONG Z W.Characteristics and cultivation techniques of Polygonatum cyrtonema Hua in shaded forest［J］.Seed Science & Technology，2024，42（7）：66-68.

[3] 雷云仙.多花黄精的特征特性及林下栽培技术［J］.现代农业科技，2020（22）：54-55.

[4] LEI Y X.Characteristics and cultivation techniques of Polygonatum cyrtonema Hua［J］.Modern Agricultural Science and Technology，2020（22）：54-55.

[5] 罗敏，章文伟，邓才富，等.药用植物多花黄精研究进展［J］.时珍国医国药，2016，27（6）：1467-1469.

[6] LUO M， ZHNAG W W， DENG C F，et al.Advances in studies of medicinal crop Polygonatum cyrtonema Hua［J］.Lishizhen Medicine and Materia Medica Research，2016，27（6）：1467-1469.

[7] XIAO J D， XIE L M， ZHENG B，et al. Polygonatum cyrtonema saponin supplementation ameliorated DSS-induced intestinal barrier injury via targeting the PI3K/AKT/mTOR-mediated autophagy/microbiota axis［J］.Food Bioscience，2024，61（22）：104727.

[8] 陈祖铿.植物的生殖讲座（八）：植物生殖生物学研究进展［J］.生物学通报，1996，31（10）：29-31.

[9] CHEN Z K.Lecture on plant reproduction （VIII）：research progress in plant reproductive biology［J］.Bulletin of Biology，1996，31（10）：29-31.

[10] 王康鑫，王仕沁，王毅敏，等.濒危植物小勾儿茶大小孢子发生和雌雄配子体发育［J］.植物研究，2024，44（5）：662-669.

[11] WANG K X， WANG S Q， WANG Y M，et al.Megasporogenesis，microsporogenesis and development of male and female gametophytes of endangered Berchemiella wilsonii ［J］.Bulletin of Botanical Research，2024，44（5）：662-669.

[12] 施慧嫒，陈发菊，梁宏伟，等.濒危植物瑶山苣苔的大小孢子发生和雌雄配子体发育研究［J］.植物研究，2021，41（3）：329-335.

[13] SHI H A， CHEN F J， LIANG H W，et al.Sporogenesis and gametogenesis on endangered Dayaoshania cotinifolia ［J］.Bulletin of Botanical Research，2021，41（3）：329-335.

[14] 王金子.玉簪大小孢子发生及雌雄配子体发育［J］.华中农业大学学报，2011，30（3）：295-299.

[15] WANG J Z.The mega-/micro-sporogenesis and female-/male-gametogenesis of Hosta plantaginea Aschers［J］.Journal of Huazhong Agricultural University，2011，30（3）：295-299.

[16] BARRANCO-GUZMÁN Á M， RODRÍGUEZ-GARAY B.Development of the female gametophyte of Agave colimana，subgenus Littaea （Asparagaceae）［J］.The Journal of the Torrey Botanical Society，2020，147（3）：281-288.

[17] 宫丽婷，吕东明，王天媛，等.玉竹小孢子发育的研究［J］.人参研究，2016，28（3）：38-41.

[18] GONG L T， LÜ D M， WANG T Y，et al.Interrelation of cytological development period of Polygonatum odoratum microspore and the morphology of flower organ［J］.Ginseng Research，2016，28（3）：38-41.

[19] SONG Y Y， ZHAO Y Y， LIU J X.Embryology of Polygonatum （Asparagaceae） and its systematic significance［J］.Phytotaxa，2018，350（3）：235-246.

[20] 李华荣，周财，魏薇，等.湖北黄精大小孢子发生及雌雄配子体发育［J］.西北植物学报，2024，44（5）：813-823.

[21] LI H R， ZHOU C， WEI W，et al.The reproductive biology theory of sporogenesis and gametogenesis in Polygonatum zanlanscianense Pamp［J］.Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，2024，44（5）：813-823.

[22] MOSER M， GROVES N R， MEIER I.The Arabidopsis KASH protein SINE3 is involved in male and female gametogenesis［J］.Plant Reproduction，2024，37（4）：521-534.

[23] HUANG X R， SUN M X.Epigenetic regulation and intercellular communication during male gametophyte development［J］.Journal of Plant Physiology，2021，258：153391.

[24] WANG X Y， WANG X Q， GAO F，et al.Polysaccharides from Polygonatum cyrtonema Hua prevent depression-like behaviors in mice with chronic unpredictable mild stress through refining gut microbiota-lipopolysaccharide-paraventricular nucleus signal axis［J］.Heliyon，2024，10（19）：e38554.

[25] 孙思宇，王华磊，陈松树，等.不同品系多花黄精药理和食用成分比较研究［J］.食品安全质量检测学报，2022，13（22）：7272-7278.

[26] SUN S Y， WANG H L， CHEN S S，et al.Comparative study on pharmacological and ediable components of different strains of Polygonatum polyflora ［J］.Journal of Food Safety and Quality，2022，13（22）：7272-7278.

[27] 田雪丽，冉舞，陆红霞，等.油茶林下黄精高产栽培技术及病虫害防治措施［J］.种子科技，2024，42（15）：4-6.

[28] TIAN X L， RAN W， LU H X，et al.Cultivation techniques of high-yield yellow essence under Polygonatum sibiricum oleifolia forest and measures of pest control［J］.Seed Science & Technology，2024，42（15）：4-6.

[29] 白洁，周涛，马江，等.三叶木通大小孢子发生和雌雄配子体发育研究［J］.植物研究，2022，42（6）：946-955.

[30] BAI J， ZHOU T， MA J，et al.Sporogenesis and gametogenesis of Akebia trifoliata ［J］.Bulletin of Botanical Research，2022，42（6）：946-955.

[31] 王瑞，胡玥，崔宏安，等.19种菊科植物花药结构及绒毡层的发育类型研究［J］.草业学报，2020，29（6）：182-190.

[32] WANG R， HU Y， CUI H A，et al.Anther structures and tapetum development types of 19 species of Asteraceae［J］.Acta Prataculturae Sinica，2020，29（6）：182-190.

[33] ZHANG H Y， ZHANG X Y， NING K，et al.Stamen and pollen development in Menispermaceae with contrasting androecium structure［J］.Plant Systematics and Evolution，2022，308（5）：36.

[34] GAO X L， YANG Y， YE J W，et al.Abnormal calcium accumulation and ROS homeostasis-induced tapetal programmed cell death lead to pollen abortion of petaloid-type cytoplasmic male sterility in Camellia oleifera ［J］.Agronomy，2024，14（3）：585.

[35] DAVIS G L.Systematic embryology of the angiosperms［M］.Hoboken：John Wiley & Sons，1967.

[36] AKITA K， TAKAGI T， KOBAYASHI K，et al.Ultrastructural characterization of microlipophagy induced by the interaction of vacuoles and lipid bodies around generative and sperm cells in Arabidopsis pollen［J］.Protoplasma，2021，258（1）：129-138.

[37] XIA C， WANG Y J， LIANG Y，et al.The ARID-HMG DNA-binding protein AtHMGB15 is required for pollen tube growth in Arabidopsis thaliana ［J］.The Plant Journal，2014，79（5）：741-756.

[38] 孙颖，王蕾，杨雪，等.侧金盏大小孢子发生及雌雄配子体发育［J］.东北林业大学学报，2017，45（7）：61-65.

[39] SUN Y， WANG L， YANG X，et al.Megasporogenesis，microsporogenesis and development of male and female gametophytes of Adonis amurensis Regel et Radde［J］.Journal of Northeast Forestry University，2017，45（7）：61-65.

[40] 孙豪愽，孔冬瑞，胡德昌.砂引草（紫草科）大小孢子发生和雌雄配子体发育及其分类学意义［J］.植物研究，2024，44（1）：27-33.

[41] SUN H B， KONG D R， HU D C.Sporogenesis and gametogenesis of Messerschmidia sibirica L.（Boraginaceae） and their taxonomic implications［J］.Bulletin of Botanical Research，2024，44（1）：27-33.

[42] 付琳，徐凤霞，曾庆文，等.广西含笑的小孢子发生及雄配子体形成的研究［J］.广西植物，2011，31（3）：312-317.

[43] FU L， XU F X， ZENG Q W，et al.Studies of microsporogenesis and male gametophyte formation of Michelia guangxiensis ［J］.Guihaia，2011，31（3）：312-317.

基金资助

湖北省中央引导地方发展专项(Z2022387)