濒危植物小勾儿茶大小孢子发生和雌雄配子体发育

Megasporogensis, Microsporogenesis and Development of Male and Female Gametophytes of Endangered Berchemiella wilsonii

摘要

运用石蜡切片技术对小勾儿茶（Berchemiella wilsonii）进行生殖生物学观察，探讨其大小孢子发生和雌雄配体发育过程是否存在濒危环节。结果显示：小勾儿茶的花具5个雄蕊和4个花药室，成熟的花药壁由花药内壁（1层）、中层（2层）和绒毡层（1层）组成。绒毡层发育正常，细胞排列整齐规则，与中层细胞联系紧密，细胞中常多核。小孢子母细胞在减数分裂时胞质分裂方式为同时型，四分体主要以四面体形式存在，花粉粒在成熟时为二细胞型、圆形或椭圆形，多数有3根萌发管。花药发育过程中绒毡层发育存在少量异常，花粉存在少量败育。小勾儿茶子房2室，只发育1室。胚珠为倒生的双珠被和厚珠心，合点端大孢子发育成功能性大孢子，经过3次有丝分裂，进一步发育成具有7个细胞和8个核的胚囊，胚囊发育方式为蓼型。子房中的胚珠发育基本一致。小勾儿茶大小孢子发生和雌雄配子体发育基本正常，不是导致其结实率低的原因。

Abstract

To explore whether there were any endangered links in sporogenesis and development of male and female gametophyte of endangered Berchemiella wilsonii， the reproductive biology of B. wilsonii was observed using paraffin section technique. The results showed that the flower of B. wilsonii had five stamens， four anthers， and the mature anther wall was composed of one inner layer， two middle layers and one tapetal layer. The tapetum developed normally with regularly arranged cells closely connected with the middle layer cells containing multiple nuclei in each cell. The cytoplasmic division of microspore mother cells was synchronous during meiosis， and mainly formed tetrahedral tetrads， the mature pollen grains were bicellular， round or oval in shape， which most of them had three germinating tubes. There were a few abnormal tapetum development and a few abortive pollen during anther development. B. wilsonii had two locule in ovary， only one chamber developed. The ovule was anatropous double integuments and crassinucellate. The chalazal end megaspore developed into functional megaspores，which underwent three times consecutive mitosis and further developed into polygonum embryo sac with seven cells and eight nucleus. Ovary ovule development was basically synchronized. The process of the mega-microsporogenesis and development of female and male gametophyte of B. wilsonii were normal， which was not the reason for the low seed setting rate.

Graphical abstract

关键词

小勾儿茶 / 胚胎学 / 大小孢子发生 / 雌雄配子体发育

Key words

Berchemiella wilsonii / embryology / macrosporogenesis / male and female gametophyte development

小勾儿茶（Berchemiella wilsonii）为鼠李科（Rhamnaceae）落叶灌木，最早于1907年被英国植物学家Wilson在湖北省兴山县采到，并由Schneider命名为Chaydaia wilsonii，后被Nakai归并到小勾儿茶属（Berchemiella）中^［1-2］。此后近百年，小勾儿茶再未被发现，直到2001年Li等^［3］在湖北五峰再次发现该植物，随后又在其他地区陆续发现该物种^［4-7］。小勾儿茶为中国特有种，零星分布于湖北省和浙江省的局部地区，生于海拔400~1 300 m山地林中，数量极其稀少，分布区极其狭窄，并受人为活动影响，原国家林业局在2012年颁布的《全国极小种群野生植物拯救保护实施方案（2010—2015）》中，小勾儿茶作为最先受到保护的濒危植物，被列入IUCN的极危种^［8］极小种群，2021年被列为国家Ⅱ级重点保护野生植物。小勾儿茶因其特殊的发现历史，限制了国内外学者对其繁殖生物学的研究，目前仅见群落生态学^［9］、分类学^［10］、基因组学^［11］和引种^［12］等相关研究。

植物个体及种群扩大通常是靠其成功的有性生殖过程来实现的，而有性生殖过程异常是濒危植物致危的主要原因之一^［13］。前期的观察发现，小勾儿茶结实率较低且瘪壳率高。鉴于此，本研究运用石蜡切片技术对小勾儿茶大小孢子发生和雌雄配体发育过程进行研究，旨在探寻小勾儿茶结实率低下的胚胎学因素，探讨其在有性生殖过程中是否存在濒危环节，为有效保护该物种提供理论依据。

1 材料与方法

以栽培于湖北省宜昌市三峡植物园（30°39′N，111°27′E）的小勾儿茶为研究对象，在其 花芽分化的不同时期定期取样（每周1次）至花 朵散粉结束，样品用FAA固定液固定后，置于冰 箱中4 ℃保存。利用石蜡切片技术^［14］，以8~10 μm厚度切片，利用番红-固绿染液染色、脱水、透明 及封片。在光学显微镜（Olympus BH2，日本）下镜检。

2 结果与分析

2.1　花药壁的发育

小勾儿茶的花具有5枚雄蕊，每枚花药具有4个小孢子囊（图1A）。在花药刚开始发育阶段，表皮下方的细胞首先发育成为孢原细胞，孢原细胞的体积较大，细胞核也较大，细胞胞质较厚，在平周分裂之后，进一步分化为外围的初生壁细胞和内侧的初生造孢细胞，初生造孢细胞在经历数次分裂之后产生形状为多边体的次生造孢细胞。初生壁细胞经平周和垂周分裂后形成4~5层同心圆排列的细胞，即形成1层花药内壁、2层中层和1层绒毡层，此时花药壁各层细胞区别并不明显，早期的绒毡层细胞多为单核（图1B）。在花药壁逐渐发育过程中，次生造孢细胞慢慢发育成小孢子母细胞，花药壁发育完全，由表皮、花药内壁、扁平状的中层（2层）及绒毡层组成；绒毡层发育正常，细胞排列整齐规则，与中层细胞联系紧密，细胞中常多核；中层细胞开始解体。小孢子母细胞进入减数分裂期时，药室的绒毡层与药壁开始脱离，靠绒毡层的一层中层细胞最先解体，同时另一层中层细胞也逐渐解体（图1C）。到四分体时期，绒毡层细胞排列不规则，细胞形态消失，中层细胞解体被压扁成线形（图1D）。当四分体将小孢子释放出来时，绒毡层不断为小孢子提供充足的营养。当进入二核花粉粒时期多数绒毡层已经消耗，花药内壁明显增大，并沿径向延长，内切向壁出现条状纤维增厚（图1E）。随着花药的发育和成熟，只保留了花药室纤维状和增厚的壁及表皮，绒毡层和中间层细胞慢慢完全退化（图1F）。

2.2　小孢子发生和雄配子体发育

经过孢原细胞分裂，初生造孢细胞生成，并进一步发育为次生造孢细胞（图2A）。次生造孢细胞经有丝分裂后发育成体积较大、核和质均浓厚的小孢子母细胞（图2B）。小孢子母细胞通过2次减数分裂形成4个呈四面体状的四分体，其周围被胼胝质壁包围（图2C、2D）。小勾儿茶小孢子母细胞通过同时型的方式进行质分裂。

在胼胝质逐渐溶解过程中，4个小孢子相互分离并释放至药室。初次释放的小孢子细胞质浓度高且细胞核几乎处于细胞正中心，即处于单核居中期。随后小孢子体积增大，形成1个巨大液泡，并使得细胞核逐渐迁移到细胞最外层，在此阶段小孢子进入了单核靠边期（图2E）。随后小孢子不断积累细胞物质，进行有丝分裂，1个大的营养核和1个小的生殖核便形成了。最终经过不断的发育形成二细胞型花粉粒，也就是雄配子体（图2F）。花粉粒在成熟时呈现圆形或椭圆形，并通常具有3个萌发管（图2G）。花药在发育过程中偶尔出现少量败育现象，在四分体前期之前，绒毡层会提前降解，导致无法形成成熟的花粉粒（图2H）。小孢子发育过程中，如果绒毡层没有及时降解，小孢子将缺乏足够的营养并且体积变小且无细胞核存在（图2I），尽管这种情况发生概率很低。

2.3　大孢子发生与雌配子体发育

小勾儿茶子房2室，每子房内具2个胚珠（图3A）。子房发育初期，在腹缝线处有多数较强分裂能力、表面呈块状整体突起的细胞，为胚珠原基（图3B）。胚珠原基顶端的细胞进一步分化形成珠心，在珠心组织表皮下有一种特殊的细胞，细胞体积增大，细胞核大、细胞质致密，为雌性孢原细胞（图3C）。造孢细胞不断发育，最后分化成细胞核大、细胞质致密的细胞，这就是大孢子母细胞（图3E）。珠心组织细胞分化为内珠被和外珠被，外珠被发育快于内珠被，逐渐包住珠心和内珠被。之后，外珠被一侧的发育速度较快，胚珠逐渐弯曲，最终发展为倒胚珠（图3D）。经过减数分裂后大孢子母细胞形成线形大孢子四分体。靠近珠孔末端的3个大孢子慢慢变小并退化，距离合点端较近，只留下1个大孢子，也就是功能大孢子。小勾儿茶胚珠发育成厚的珠心型（图3F）。功能大孢子进一步发育成单核胚囊，胚囊核大，体积增大。单核胚囊经过3次有丝分裂，第1次分裂形成2个核，2个核向相反的两端移动，即二核胚囊型（图3G）。随后进行2次分裂生成7个细胞8个核胚囊，其大小显著扩张（图3H）。其中1个核从每端移动至中央并结合为1个次生核（图3H、3I）。珠孔端产生1个卵细胞和2个助细胞，构建卵器，并呈现“品”字形排列（图3H、3J、3K）。靠近合点端的3个细胞则是反足细胞（图3L）。小勾儿茶胚囊发育类型为蓼型。

3 讨论

小勾儿茶花具有5枚雄蕊，1枚花药包含4个小孢子囊，小孢子母细胞胞质分裂方式为同时型，四分体呈现四面体形，花粉粒在成熟时为二细胞型，呈圆形或椭圆形，大多有3根萌发管。小勾儿茶2室子房，倒生胚珠，双珠被，厚珠心，经过3次有丝分裂的靠近合点端的功能大孢子形成具有7个细胞和8个核的胚囊，胚囊发育方式为蓼型。这与之前报道^［15-17］的冬枣（Ziziphus jujuba ‘Dongzao’）、秋酥脆枣（Z. jujuba ‘Zhongqiusucui’）、南酸枣（Choerospondias axillaris）描述特征基本一致。研究结果表明，小勾儿茶与其他鼠李科物种存在系统发育上的一致性，也为确定鼠李科胚囊发育类型提供了依据。

小勾儿茶花药在不同药室中的小孢子存在发育不一致的情况，同一药室的4个孢子囊发育基本同步。这与同科植物冬枣的小孢子、雄配子体及花药壁的发育过程^［15］相似。花粉的正常发育，以及从花药中释放是成功繁殖的必要条件。在植物中，花粉在其发育过程中的每一个时期均有可能选择性发生败育，在濒危植物羊角槭（Acer yanjuechi）的研究中，其胼胝质提早溶解，细胞相互粘连，细胞质壁分离明显，细胞干瘪、内陷等，使成熟花粉粒成为功能上雄性不育^［18］。其他濒危植物如庙台槭（Ace miaotaiense）^［19］、西畴含笑（Michielia Coriacea）^［20］等也出现相同的情况。成熟花粉粒的形成依赖于表皮层、内壁、中层和绒毡层，特别是绒毡层在小孢子发育中起着重要作用^［21］。在同科植物中造成枣树雄性不育花粉败育的主要原因是四分体时期绒毡层肥大、增厚^［22］。绒毡层细胞液泡化、细胞质稀少、非正常膨大、解体时间提前或推迟可能是导致大叶铁线莲（Clematis heracleifolia）花粉败育的原因^［23］。也有研究人员认为小孢子发生和雄配子体形成过程存在的异常现象是濒危植物濒危的原因，如濒危植物羊角槭^［18］、宝华玉兰（Magnolia zenii）^［24］在大小孢子及雌雄配子体发育过程中均有败育现象。通过显微结构观察发现小勾儿茶在形成四分体前期，绒毡层提前降解，小孢子发育过程中，绒毡层延时降解，小孢子体积小且没有细胞核，花粉存在少量败育，但发生的概率低，大多能够正常发育成熟。小勾儿茶子房中的胚珠发育基本同步，偶尔出现发育不同步的现象，而枣的胚珠通常只在1个子房发育，而在另1个子房退化，或者2个胚珠同时败育，不同的品种败育表现的形式不同^［25］。小勾儿茶为两性花，雌雄蕊发育时期存在差异，雄蕊的发育时期明显早于雌蕊，当小孢子母细胞开始减数分裂时，大孢子还处于孢原细胞阶段，发育后期雌蕊发育加快，至二核胚囊经历的时间较长，花蕾开放时雌雄蕊发育达到同步。这种雌雄发育不同步现象是一种有效延长授粉期的雌雄异熟机制^［26］，这与濒危半红树植物莲叶桐（Hernandia nymphaeifolia）、珙桐（Davidia involucrate）的特征^［27-28］类似。总体来说，小勾儿茶大孢子发生、雌配子体发育过程基本正常。

植物有性生殖是否成功，对物种的持续演化和种群的扩张起着关键作用，跟其有关联的过程主要有花芽分化、雌雄配子形成、传粉受精、胚胎发育和种子形成。对于这些生殖过程，任何一种异常现象都可能导致不同程度的生殖失败，并进而对植物造成濒危威胁^［29-30］。在对小勾儿茶雌雄配子体发育进行细胞学观察时，笔者发现花药发育过程存在少量的绒毡层异常，但大部分花粉均能发育成熟，少量的花粉败育对其生殖影响不大。此外，在雌配子体形成过程中未出现任何异常。因此，小勾儿茶在雌雄配子体发育过程中不存在致濒环节。未发表的传粉生物学数据表明，小勾儿茶为异花授粉且需要传粉者，但小勾儿茶在分布区种群数量少，存在花粉源限制，不利于异花授粉结实，这可能是其濒危的原因之一。

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基金资助

宜昌市科技研究与开发项目(A21-4-013)