马尾松原生质体制备及瞬时转化体系的建立

Establishment of a System for Preparation and Transient Transformation of Protoplasts of Pinus massoniana

摘要

该研究旨在通过建立马尾松（Pinus massoniana）原生质体的分离和制备系统，实现基因的瞬时转化，从而推动马尾松基因功能研究和遗传转化体系的发展。研究选取了马尾松不同发育时期的外植体材料，包括针叶、下胚轴和愈伤组织，探讨了不同酶解条件对原生质体分离效率的影响，并通过试验优化了马尾松原生质体的制备流程，涉及不同类型的组织、不同的渗透压和酶解时间。研究结果表明：在0.5 mol⋅L^-1甘露醇渗透液中，使用马尾松针叶组织进行6 h酶解处理是提取原生质体的最佳条件。基于此，该研究构建了一个适合马尾松的瞬时转化体系，并通过对比不同转化条件，实现了外源基因在马尾松原生质体中的瞬时表达。研究还发现，经过优化的原生质体制备体系能够显著提升原生质体的质量和转化效率，在使用聚乙二醇（PEG）介导的转化方法时，转化效率高达47.83%。综上，该研究成功构建了马尾松原生质体高效分离体系，为针叶树种基因功能解析提供了可靠的瞬时表达系统。

Abstract

This study aimed to establish a system of the protoplast preparation in Pinus massoniana for the transient transformation of genes， so as to promote the study of gene function and the development of genetic transformation system in P. massoniana. The explants were selected from different developmental periods of P. massoniana， including needle leaf， hypocotyls and callus tissues. The effects of different enzymatic conditions on the isolation efficiency of protoplasts were explored. The protoplasts preparation process involving different types of tissues， different osmotic pressures and enzymatic hydrolysis time were optimized. The results showed that pine needle tissue in 0.5 mol⋅L^-1 mannitol osmotic solution for 6 h was the optimal condition for protoplasts extraction. Based on this， a transient transformation system of exogenous genes expression in P. massoniana protoplasts was constructed by comparing different transformation conditions. The optimized protoplast preparation and transformation system could significantly improve the quality and transformation efficiency of protoplasts， and the transformation efficiency of protoplasts was as high as 47.83% when using a polyethylene glycol （PEG）-mediated transformation method in P. massoniana. In summary， this study successfully constructed an effective protoplast isolation system for P. massoniana， which provides a reliable transient expression platform for analyzing gene functions in coniferous species.

Graphical abstract

关键词

马尾松 / 原生质体 / 瞬时转化 / 基因功能

Key words

Pinus massoniana / protoplast / transient expression / gene function

马尾松（Pinus massoniana）在中国亚热带地区是一种十分重要的经济与生态树种^［1］。除了有耐干旱瘠薄、适应性强等特点，马尾松的木材还是重要的林特产资源，综合利用价值极高，其林业地位不断提高^［2］。遗传改良对于提高马尾松生长速度、适应性和抗病虫害能力具有重要意义。由于马尾松的生命周期较长，遗传背景复杂，加之遗传转化效率较低，目前尚未建立起高效稳定的遗传转化体系^［2］，这些因素极大地阻碍了马尾松在分子育种及功能基因组学等领域的进一步研究。

植物的原生质体是指去除了细胞壁的植物细胞，保留了细胞膜和细胞质，具有全能性，以植物原生质体为基础的瞬时表达技术因快捷、高效的特性，能在转化后较短时间内得到基因活性表征^［3-4］。因此，原生质体是遗传育种、遗传转化研究的理想材料，在遗传学、分子生物学研究及生物工程技术应用中扮演着重要角色^［3］，在多个领域具有广泛的应用前景，如可以应用于单细胞测序、基因表达调控、植物遗传工程及基因与蛋白互作等遗传转化的相关研究^［4-5］。之前有研究^［6］利用杨树（Populus）分离的原生质体进行单细胞转录组分析，鉴定了一系列可能调控导管和纤维发育的潜在调控因子；Patra等^［7］在长春花（Catharanthus roseus）叶肉原生质体中瞬时过表达CrMYC2来监测其基因表达水平。这些研究进展不仅证实了原生质体系统的技术优势，更凸显了其在解析植物发育分子机制中的关键作用。

目前，原生质体的分离方法主要有酶解法、梯度离心法和机械分离法等，其中机械法会在质壁分离时将细胞壁切破，早期从大型藻类中分离原生质体是通过机械法完成的，分离出的原生质体产量较少，破损率较高^［8-9］；而酶解法由于其条件温和是最为常用且适用范围广泛的一种方法，得率较高并且得到的原生质体具有良好的完整性^［10］。然而由于原生质体的生存条件比较苛刻，其制备受到植物类型、酶浓度、溶液渗透压、酶解时间等多重因素的影响^［11-12］。近年来，有关拟南芥（Arabidopsis thaliana）^［13］、玉米（Zea mays）^［14］、小麦（Triticum aestivum）^［15］等原生质体分离和转染的研究已较为成熟，然而目前对于马尾松原生质体分离和转染的研究较少。马尾松基因研究主要依赖于异源转化，这在一定程度上限制了对其基因功能的深入研究^［16］。因此，马尾松原生质体分离技术尚不完善，仍需进一步探索。建立针叶树种原生质体分离和制备的有效方法显得更为重要。

本研究以马尾松的不同组织为试验材料，探索不同因素对原生质体分离和制备的影响，利用马尾松针叶构建一种快速有效的原生质体制备技术，从而成功获得高产量且高活性的原生质体。随后利用PEG 4000介导法将携带绿色荧光蛋白（GFP）标签的空载体转入原生质体中，使外源DNA可以在马尾松原生质体中瞬时表达，验证其作为有效分子工具的潜力。这一研究可为高通量基因功能分析提供理想样本，并为后续更深入的遗传转化研究奠定基础，为马尾松遗传性状快速改良带来新的机遇。

1 材料和方法

1.1　植物材料

本研究所使用的马尾松幼苗均为播种后在光照培养箱生长14 d的幼苗（光照时间∶黑暗时间=16∶8），马尾松针叶分化的愈伤组织（Y-15）来自实验室25 ℃恒温悬浮培养。所有材料在试验前一天黑暗培养，选取幼嫩且生长良好的幼苗作为制备材料。将根部去掉并清洗，用吸水纸吸干水分后称量质量。为了促进酶解液渗透，用双面刀片将针叶纵向切割1次，横向切成2~5 mm；对下胚轴纵向分割2~3次，切成2~5 mm厚的片段；成团的愈伤组织用镊子分成10 mm小块。

1.2　试验方法

1.2.1　原生质体分离及制备

酶解液组成：0.4~0.7 mol·L^-1甘露醇、0.02 mol·L^-1 MES、0.02 mol·L^-1 KCl、0.3 g纤维素酶、0.15 g离析酶、0.01 mol·L^-1 CaCl₂、0.02 g BSA。ddH₂O定容至20 mL，pH调至5.7。

原生质体洗液（Cell Protoplast Wash Medium，CPW）组成：154 mmol·L^-1 NaCl、125 mmol·L^-1 CaCl₂、0.5 mol·L^-1 KCI、2 mmol·L^-1 MES，5 mmol·L^-1葡萄糖，ddH₂O定容。配置后使用0.22 μm滤膜过滤。

原生质体稀释液（Protoplast dilution solution，PDS）组成：0.4~0.7 mol·L^-1甘露醇，0.015 mol·L^-1 MgCl₂，4 mmol·L^-1 MES，ddH₂O定容至10 mL。

按照拟南芥、杨树等其他植物的原生质体提取方法，对提取过程进行了优化^［17-19］。将切好的植物材料浸入酶解液，每20 mL酶解液中植物材料的鲜质量约为0.5 g。置于摇床中在转速60 r·min^-1、25 ℃、避光条件下消化4~7 h。酶解后取出，轻轻混匀，用75 μm一次性筛网过滤掉杂质。随后将滤液移至50 mL离心管中，离心（3档升降速、100 g、3 min）后弃上清液。加入与酶解液等体积的原生质体洗液（CPW）终止酶解反应并纯化原生质体，重新悬浮原生质体后，离心（3档升降速、100 g、3 min）后弃上清液，重复2~3次纯化操作后，加入20 mL CPW溶液重悬，冰上静置，为原生质体混悬液。用血球计数板法在光学显微镜（Olympus DP21，日本）下观察并计数^［20］。在显微镜下统计16个中方格内的原生质体数量，技术重复3次，每次至少统计10个视野，最后取平均值进行统计学分析。

1.2.2　原生质体转化

用原生质体稀释液（PDS）将纯化后的原生质体稀释至2×10⁵个·mL^-1，然后在100 μL原生质体中加入10 ng去除内毒素的质粒pUC19-35S-GFP，静置3 min，加入与样品DNA及原生质体细胞总体积相等的110 μL 20%~40%PEG 4000转化溶液，轻柔颠倒混匀，室温黑暗放置20 min。加入等于2倍转化体系体积的440 μL CPW溶液，颠倒混匀室温离心（3档升降速、100 g、2 min）后弃上清液。重复2遍。加入1 mL CPW溶液，轻轻混匀，25 ℃弱光培养16 h后观察荧光信号。GFP绿色荧光和FDA荧光使用蔡司共聚焦激光扫描显微镜（ZEISS LSM900，德国）检测，每个装片拍摄3个不同视野用以统计数据。原生质体转化效率=（GFP通道下发绿色荧光的原生质体数量/明场下原生质体总数）×100%。原生质体活力采用FDA染色法测定。配置FDA染液母液（20 mg FDA溶于1 mL丙酮中），每1 mL原生质体混悬液加20 μL的FDA染色液，静置5 min后用荧光显微镜观察原生质体。原生质体活力=（暗视野下发黄绿色荧光的原生质体数量/明场视野下原生质体总数）×100%。

PEG 4000转化溶液组成：0.2 mol·L^-1甘露醇，0.1 mol·L^-1 CaCl₂，0.4 mol·L^-1 PEG 4000，ddH₂O补足所需要的体积。

1.2.3　数据处理

所有试验数据统计图通过Graph Pad Prism软件绘制。显著性分析使用SPSS 26.0数据处理软件，通过Duncan法进行单因素方差分析，以及独立样本t检验。

2 结果与分析

2.1　马尾松原生质体的提取和分离

2.1.1　原生质体分离材料优选

为了快速获得高质量的马尾松幼苗原生质体，本研究挑选了生长良好的马尾松幼苗作为制备原生质体的原始材料，使用马尾松幼苗的下胚轴、针叶和愈伤组织3种类型的外植体探究不同植物组织状态对原生质体分离情况的影响（图1）。首先根据前人的制备方法加以改进提取了马尾松的原生质体（图2），结果表明，不同植物组织状态对原生质体分离的效率有显著影响，并且随着叶片发育进程而逐渐升高（图3）。在分离效率方面，2周龄幼苗针叶和下胚轴的原生质体产量明显多于愈伤组织。具体来说，针叶原生质体数量最多，叶绿体含量丰富，在显微镜下容易观察，下胚轴提取的原生质体数量少于针叶，细胞完整度低于针叶（图3A~3B）。马尾松的愈伤组织细胞由于不含叶绿体所以难以观察，并且与下胚轴和针叶分离出的细胞相比，原生质体结构碎片且杂质较多（图3C）。综合结果表明，相较于愈伤组织，幼嫩的幼苗是马尾松原生质体理想的提取材料。

2.1.2　原生质体最佳酶解时间确定

酶解时间是影响原生质体分离的重要因素之一。在本研究前期的预试验中，马尾松组织酶解4 h后酶解液开始变绿，说明原生质体开始释放；到酶解6 h时，酶解液中出现明显的沉降聚集现象。正式试验中，将酶解时间分别设为4、5、6、7 h 4个梯度，分别计算不同酶解时间下分离的原生质体的数量和活力。随着酶解时间的增加，马尾松针叶和下胚轴的原生质体产量都呈现逐渐上升趋势，6 h针叶和下胚轴分离的原生质体活力最好， 7 h活力降低（图4A~4E）；愈伤组织分离的原生质体数量呈现先上升后下降的趋势，结果显示，在酶解5 h下原生质体的分离效果最好，原生质体活力随着时间的增加逐渐下降（图4G~4I）。上述结果表明，在幼苗组织中，6 h是最佳酶解时间；而在愈伤组织中，酶解5 h释放的原生质体质量最高。

2.1.3　原生质体最适渗透压环境确定

无细胞壁保护的原生质体能否长时间培养的主要影响因素为细胞培养液的渗透压。甘露醇在体外培养环境中作为调渗物质对维持原生质体的活力十分重要，通常，维持植物细胞渗透压的最佳甘露醇浓度为0.4~0.6 mol·L^-1［21］。因此，本研究将甘露醇的浓度设置为0.4~0.7 mol·L^-1进行梯度试验来调节培养液渗透压，以此获得马尾松原生质体的最适渗透条件。研究发现，在含有0.5 mol·L^-1 甘露醇的酶解液中，马尾松不同组织的原生质体产量和活力都是最高的，而且针叶中分离的原 生质体活力最高，达到82.8%（图5A~5C）。因此，0.5 mol·L^-1的甘露醇浓度是分离马尾松针叶原生质体相对合适的渗透压环境条件。

2.2　马尾松原生质体瞬时转化体系建立

为了更好地验证马尾松原生质体在遗传工程中的应用效果，本研究将上述新鲜材料中分离的原生质体用于瞬时转化。参照拟南芥^［22］原生质 体的转化体系，选择PEG介导法对其进行瞬时转化。本研究设立3个梯度，选取20%、30%、40%的PEG 4000对马尾松原生质体进行瞬时转化并对比其转化效率（表1）。为了方便观察转化效率，本研究将GFP的瞬时表达载体pUC19-35s-GFP作为转化对象，由于缺乏定位信号，空载体的GFP荧光会在成功转化的原生质体中均匀分布。统计最终转化表达情况，结果发现，马尾松针叶中分离的原生质体在40%的PEG 4000转化液中所获得的瞬时转化效率最高，达到47.83%。通过对马尾松原生质体制备方法的优化，使用0.5 g针叶浸入含有0.5 mol·L^-1甘露醇的酶解液中分离6 h，得到最优原生质体后进行瞬时转化，有活力的原生质体的自发荧光和绿色标签信号较明显（图6）。

3 讨论

瞬时转化体系在分子生物学研究中为基因功能分析、蛋白质研究和生物技术应用提供了一个快速、灵活且高效的平台^［23］。由于裸子植物遗传背景的复杂性，在马尾松中还鲜有关于瞬时转化体系建立的深入研究。构建高效的瞬时转化系统，关键在于采用可靠的原生质体分离技术，以确保生成大量且高活性的原生质体。目前建立的原生质体分离体系主要应用于草本植物，木本植物尤其是针叶树种细胞结构、生理状态的复杂性增加了建立原生质体分离体系的难度^［8］。本研究发现，提取方法、植物组织类型、酶解持续时间和渗透压调节物质浓度是影响马尾松原生质体制备和分离至关重要的因素。

植物细胞原生质体分离效果因所用的植物材料及其生长阶段、分离方法的不同而存在很大差异^［24-25］，拟南芥中无需切割的三明治提取法极大地缩短了处理时间^［26］，油茶（Camellia oleifera）真空渗透预处理法使得酶解液快速进入其叶片，提高了分离效率^［27］。本研究中，马尾松针叶和下胚轴呈长条状，将分离材料用锋利的双面刀片纵向切割预处理，扩大了材料和酶解液的接触面积，能在较短时间内获得足够的原生质体细胞。

初始材料的选择是成功分离植物细胞原生质体的关键，在相同条件下马尾松愈伤组织分离出的细胞数量和活性显著低于针叶和下胚轴处理组（图4~5）。本研究认为马尾松原生质体分离的首选材料是幼苗的针叶组织，在拟南芥、玉米、小麦、梨（Pyrus spp.）等植物细胞中分离原生质体时首选材料也为叶片^{［5，28-29］}，笔者推测这与初始材料的材性有关^［30］。愈伤组织较幼苗组织更加疏松易碎，并且需要长时间的组培过程，幼苗则可以在种子发芽后的几天内从下胚轴、子叶细胞中分离原生质体，综合比较，幼苗的子叶为最佳提取材料。

目前，酶解法是最常用的可以快速得到大量原生质体的制备方法，其中酶解时间和细胞渗透压对原生质体的数量和质量的影响极大。各类外植体材料在酶解过程中所需的时间存在差异^［24-26］，一般情况下，木本植物所需要的酶解时间多于草本植物。同一植物的不同部位酶解情况也受到细胞壁成分含量等因素的影响，从毛果杨（Populus trichocarpa）的茎段中分离原生质体需要6~8 h^［18］，油茶的叶片在黑暗中酶解时间至少需要10 h^［27］。不同植物材料分离原生质体时所用的渗透剂种 类和最适浓度不尽相同^［31］。本研究发现，用甘 露醇作为马尾松细胞渗透压稳定剂，其浓度均在0.5 mol·L^-1时的分离效果最好，酶解6 h可以达到原生质体的最佳分离效果，随着酶解液渗透压的增加，不同组织分离出的原生质体活力和数量均降低，造成这一现象的原因可能是较高的渗透压会导致细胞失水过多而死亡。

通过瞬时遗传转化体系将特定基因导入马尾松针叶中，可以初步判断该基因的功能，为针叶树种提供了一种快速验证基因功能的参考方法。目前PEG介导的转染技术已广泛用于许多植物物种的基因瞬时表达研究，PEG介导的原生质体转化效率与PEG浓度、原生质体活性、转化时间等因素有关^［32-34］。在不同外植体的组合中，本研究比对了不同浓度PEG 4000转化液对转化效率的影响，发现马尾松针叶在40%的PEG 4000转化液中的转化效率最高，并且活力达到了88.46%，这对于解析马尾松生长发育、逆境响应等生理过程的分子机制具有重要意义。

4 结论

本研究得到了适用于马尾松实生苗的原生质体分离和制备体系，利用其针叶可得到较高质量的原生质体，原生质体活力可达80％以上。构建了瞬时表达系统，转化效率平均达到40%，最高为47.83%。基于这些研究结果认为，在马尾松原生质体中瞬时转化靶基因是可行且有效的，这为马尾松功能基因研究及针叶树遗传育种提供了新途径。

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基金资助

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