植物热形态建成中PIF4调控SAURs基因表达

PIF4 Regulates the Expression of SAURs in Plant Thermomorphogenesis

摘要

高等植物在高于最适温度且低于逆境高温的温和高温范围内，发生的一系列形态变化统称为热形态建成。在这些形态变化中，以高温诱导的下胚轴伸长受到的关注最多，研究也最为深入。SMALL AUXIN UP RNA（SAUR）基因家族在促进生长和细胞伸长过程中发挥着重要作用。然而，对于高温调控SAURs的分子机制还知之甚少。该研究以拟南芥（Arabidopsis thaliana）Col-0野生型、pif4-2突变体和4种转基因植物为材料，采用实时荧光定量PCR、染色质免疫共沉淀、双荧光素酶报告基因检测和表型分析的方法探索了热形态建成中高温调控SAUR1~SAUR4的分子机制。结果表明：高温促进SAUR1~SAUR4转录，并且这一促进作用需要转录因子PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR 4（PIF4）；转录因子PIF4结合SAUR1~SAUR4启动子区中含有E-box的区域，并且温和高温会提高这些结合的强度；在热形态建成信号转导通路中SAUR1处于PIF4的下游；PIP4对SAUR1~SAUR4的调控需要生长素信号转导通路的参与。以上结果表明，高温通过影响PIF4与SAUR1~SAUR4启动子染色质的结合强度来调控这4个基因的转录。该研究有助于理解热形态建成中高温调控下胚轴伸长的下游分子机制，从而丰富抗热育种理论。

Abstract

Thermomorphogenesis is defined as a series of morphological changes that occur in higher plants when the temperature is higher than an optimal temperature and lower than the stress temperature. Among these morphological changes， hypocotyl elongation induced by high temperature has received the most attention and has been studied most deeply. SMALL AUXIN UP RNA（SAUR） gene family plays a key role in promoting growth and cell elongation. However， little is known about the molecular mechanism of high temperature regulation of SAURs. In this study， Arabidopsis Col-0 wild type， pif4-2 mutant and four transgenic plants were used as research materials. Real-time Quantitative PCR（qPCR）， chromatin immunoprecipitation（ChIP）， double luciferase reporter gene detection and phenotypic analysis were used to explore the molecular mechanisms of high temperature regulated SAUR1-SAUR4. The results were as follows： high temperature promoted SAUR1-SAUR4 transcription and this promotion required transcription factor PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR 4（PIF4）； transcription factor PIF4 binded to the E-box region in the promoter regions of SAUR1-SAUR4， and mild-high temperature enhanced these binding； auxin was downstream of PIF4 in the thermomorphogenesis signaling pathway； auxin signaling pathway was required for the regulation of SAUR1-SAUR4 by PIF4. These results indicated that high temperature regulated the transcription of these four genes by influencing the binding strength of PIF4 and SAUR1-SAUR4 promoter chromatin. This research deepens our understanding of the molecular mechanism underlying hypocotyl elongation downstream genes regulated by high temperature during thermomorphogenesis， thus enriching the theoretical basis of heat-resistant breeding.

Graphical abstract

关键词

热形态建成 / 下胚轴伸长 / PIF4 / SAURs

Key words

thermomorphogenesis / hypocotyl elongation / PIF4 / SAURs

高温强烈限制了植物的生长发育，同时严重威胁着农作物的质量和产量。随着全球变暖持续加剧，高温对植物生长发育的负面影响还将日益加重^［1］。高温分为逆境高温和温和高温^［2］。温和高温是指高于植物最适生长温度且低于逆境高温的温度范围^［2］。在这个温度范围内植物会发生一系列的形态变化来达到为自身降温的目的^［2］，这些形态变化统称为热形态建成。下胚轴伸长作为形态变化中最便于研究的一种，被开发为一个理想的研究模型用于科学研究。下胚轴伸长可使对高温敏感的分生组织和子叶远离炙热的地表，并使子叶接触到流动性更好的空气，进而增强蒸腾作用^［3］，这对植物的降温起到重要作用。近年来，热形态建成信号转导通路得到了广泛而深入的研究^［4］。在这个信号转导通路中转录因子PIF4和植物生长素发挥着重要作用^［4］。

温和高温诱导的下胚轴伸长在缺乏生长素合成、感知或信号转导的突变体中受到严重损害^［5］，表明生长素在热形态建成中发挥着重要作用。温和高温通过提高植物中的生长素含量来促进下胚轴伸长^［6-7］，通过促进转录因子PIF4来促进植株下胚轴的伸长生长^［8-9］。PIF4能够与YUCCA8（YUC8）、TRYPTOPHAN AMINOTRANSFERASE OF ARABIDOPSIS 1（TAA1）和CYTOCHROME P450 FAMILY 79B（CYP79B2）3个生长素合成基因的启动子区结合并促进它们的转录，进而促进生长素的合成^［6-7］。

另外，SMALL AUXIN UP RNA（SAUR）基因家族作为生长素响应基因，在植物生长和细胞伸长过程中发挥着重要作用^［10］。其中一种已知机制是SAUR蛋白通过抑制特定的蛋白磷酸酶（PP2C.D型蛋白磷酸酶）来增加质膜上的H⁺-ATP酶在Thr947位点的磷酸化。H⁺-ATP酶活性的提升导致质外体酸化^［11-12］。因为H⁺-ATP酶通过消耗ATP能量来从细胞内向细胞外泵送质子（H⁺），从而降低细胞壁pH。细胞壁酸化提高了细胞壁松弛剂（如膨胀素）的活性，这些松弛剂可以提高细胞壁的延展性，从而促进拟南芥（Arabidopsis thaliana）下胚轴细胞的扩展，使下胚轴伸长^［13］。另一种机制是SAUR62/75与核糖体蛋白RPL12家族成员相互作用，促进花粉管生长所需的核糖体组装和蛋白质翻译^［14］。综上所述，在温和高温条件下植物通过转录因子PIF4来促进生长素合成基因表达，进而提高植物体内生长素含量及生长素响应SAURs基因来促进植株下胚轴的伸长生长。

本研究选取4个SAUR（SAUR1、SAUR2、SAUR3和SAUR4）基因家族的成员，探究其在热形态建成中的参与情况，以及与转录因子PIF4的关系。本研究发现，在温和高温中，转录因子PIF4通过与SAUR1~SAUR4基因启动子区的结合来增强它们的转录，进而促进下胚轴伸长。通过这一调控过程，转录因子PIF4能够快速调控SAUR1~SAUR4基因的转录，形成了一条温度信号转导通路的捷径，使植物提升对高温的响应速度，并增强自身适应环境的能力。

1 材料与方法

1.1　试验材料

选用模式植物拟南芥为试验材料。野生型采用Columbia-0（Col-0）生态型，突变体植物采用pif4-2。转基因植物采用35S：：PIF4-HA/Col-0、SAUR1ox 1-3/Col-0、SAUR1ox 2-12/pif4和SAUR1ox 2-17/pif4。其中Col-0、pif4-2和35S：：PIF4-HA/Col-0由中国科学院光生物学重点实验室提供，其他植物为本试验构建。pUC-35sLUC质粒由中国科学院光生物学重点实验室提供。

1.2　植物培养条件

将少量拟南芥种子放入1.5 mL离心管中，加入1 mL 1.5% NaClO+2 μL 20% Triton X-100，摇晃洗涤15 min，再用无菌水洗涤3次。在超净工作台中将种子置于1/2MS培养基上，4 ℃春化3 d后 转移到持续白光光照条件下培养。用qPCR和ChIP试验的幼苗均在20 ℃持续白光光照条件下培养6 d，然后分别转入20 ℃和29 ℃培养条件下继续培养6 h。取整株幼苗放入液氮中冷冻并 放入冰箱中-80 ℃存储待用。用于表型研究试 验的幼苗均在20 ℃和29 ℃持续白光光照条件 下培养8 d后使用。光照处理的持续白光光强为25 µmol·m^-2·s^-1。

1.3　载体构建

为了获得SAUR1的编码序列，从Col-0野生型幼苗中提取总RNA，利用寡核苷酸（dT）引物对第一链cDNA进行逆转录。利用高保真Pfu DNA聚合酶（Invitrogen）和扩增SAUR1序列（引物见表1），克隆到pEASY中，得到pEASY-SAUR1。将pEASY-SAUR1质粒用XbaⅠ和SalⅠ酶切释放SAUR1编码序列，然后将其连接到用相同酶切的修饰后的pCAMBIA1302（http：//www.cambia.org/daisy/cambia/585）中，生成35S：：SAUR1-GFP。所有扩增片段均经测序验证。

在拟南芥Col-0基因组中，使用Pfu DNA聚合酶扩增SAUR1、SAUR2、SAUR3和SAUR4的启动子区（起始密码子ATG上游2.0 kB的DNA片段）（引物见表1）。在拟南芥Col-0的cDNA中，使用Pfu DNA聚合酶扩增PIF4的编码区（引物见表1）。扩增所得片段均经过DNA测序检测无误后连接到pEASY-Blunt载体（TransGen），获得pEASY-SAUR1p、pEASY-SAUR2p、pEASY-SAUR3p、pEASY- SAUR4p和pEASY-PIF4。使用TaKaRa MutanBEST kit突变SAUR1~SAUR4被PIF4结合区域的E-box，产生pEASY-SAUR1p（mut）、pEASY-SAUR2p（mut）、pEASY-SAUR3p（mut）和pEASY-SAUR4p（mut）。将来自pEASY-PIF4（经EcoRI和XhoI酶切）的PIF4编码区插入pGreenⅡ 62-SK（经EcoRI和XhoI酶切）中产生35S：PIF4（在试验中作为效应基因使用）。使用XhoⅠ和BamHⅠ酶切pEASY-SAUR1p、pEASY-SAUR2p、pEASY-SAUR3p和pEASY-SAUR4p及其突变版本，将获得的启动子区序列插入pGreenⅡ 0800-LUC载体（经XhoⅠ和BamHⅠ酶切）获得pSAUR1：LUC、pSAUR2：LUC、pSAUR3：LUC和pSAUR4：LUC及其突变版本（在试验中作为报告基因使用）。

1.4　拟南芥的转基因

利用电击法将二元载体转入农杆菌（Agrobacterium）菌株GV3101中，通过花浸渍法转移到野生型Col-0和pif4植株中^［15］。在含有50 mg·L^-1卡那霉素的1/2MS培养基上对转基因植株进行筛选，本研究使用T3代的纯合子系作为试验材料。

1.5　下胚轴拍照及数据处理

测量下胚轴长度时，将不同基因型的幼苗置于同一平板上共同培养，每个试验均设置至少3个独立的平板做重复。对幼苗拍照后使用Image-J软件（http：//rsb.info.nih.gov/ij）测量其下胚轴长度，并进行数据处理及分析。

1.6　拟南芥中总RNA的提取和逆转录

参照天根多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（DP432）说明书中的操作方法，进行Col-0野生型幼苗中总RNA的提取。参照天根FastKing cDNA第一链合成试剂盒（KR116）说明书中的操作方法，对提取的总RNA进行逆转录。

1.7　实时荧光定量PCR试验

采用天根RNAprep Pure Plant Kit提取植物总RNA，采用Reverse Transcriptase（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）的oligo（dT）合成第一链cDNA。使用ACT2作为内参，参照SYBR预混试剂盒（Tiangen）说明书中的操作方法，进行qPCR。qPCR引物组见表2。

1.8　染色质免疫共沉淀（ChIP）试验

染色质免疫共沉淀试验参照前人^［16］的方法进行。用HA抗体或IgG血清沉淀蛋白-DNA样品，使用表3中列出的引物进行qPCR定量DNA。相对富集以HA抗体免疫沉淀后的DNA量与IgG血清对照的DNA量之比表示。采用2^-∆∆Ct法进行数据分析。

1.9　双荧光素酶报告基因检测

采用双荧光素酶报告基因检测法进行瞬时启动子激活试验^［17］。本研究的待转化植物选用了本特哈曼烟草（Nicotiana benthamiana）。在烟草长出7~8片叶时，选用位于中间的3~4片叶作为待转化叶片。将报告基因、效应基因和pGreenII 62-SK空载体转化到农杆菌菌株GV3101中，再共侵染选好的烟草叶片。侵染完成后继续培养烟草48~72 h，使用双荧光素酶测定试剂盒（Vazyme）测定萤火虫荧光素酶（LUC）活性与豚鼠荧光素酶（REN）信号活性的相对比值。以LUC/REN值来代表HY5对各启动子的调控作用。

1.10　数据处理

利用IBM SPSS Statistics进行单因素方差分析，利用Duncan’s多重比较检验数据间的差异。差异达到显著水平用*表示（P<0.05），差异达到极显著水平用**表示（P<0.01），差异显著用不同小写字母表示。

2 结果与分析

2.1　温和高温对SAURs表达的影响

本研究首先检测了4个SAUR基因（即SAUR1~ SAUR4）的转录是否受到高温的影响。如图1所示，与20 ℃相比，SAUR1~SAUR4的表达量在29 ℃条件下显著升高，说明温和高温促进了SAUR1~ SAUR4基因转录（图1）。

2.2　转录因子PIF4直接调控SAURs的表达

2.2.1　 SAURs表达受到转录因子PIF4调控的影响

本研究检测了转录因子PIF4影响SAUR1~ SAUR4基因对温和高温的响应程度。如图2所示，温和高温显著提升了野生型幼苗SAUR1~SAUR4的转录本水平；而在温和高温条件下，pif4突变体幼苗中SAUR1~SAUR4基因的表达量显著低于野生型幼苗。这些结果表明，温和高温是通过转录因子PIF4来促进SAUR1~SAUR4转录的。

2.2.2　转录因子PIF4与SAURs启动子区的结合情况分析

PIF4是bHLH转录因子家族的成员，能够与靶基因启动子区的E-box（CANNTG）顺式作用元件^［18］结合。启动子区分析结果表明，SAUR1~SAUR4启动子区存在多个E-box顺式作用元件（图3A）。根据SAUR1~SAUR4启动子区E-box顺式作用元件的分布情况，分别选取了SAUR1、SAUR2、SAUR3和SAUR4启动子的4个区域设计qPCR扩增引物，每个区域分别包含1~4个E-box（图3A）。结果显示，SAUR1启动子的片段3和4出现了富集现象（图3B~3C），SAUR2启动子的片段1和2出现了富集现象（图3D~3E），在SAUR3启动子的片段4出现了富集现象（图3F~3G），在SAUR4启动子的片段3和4出现了富集现象（图3H~3I），并且29 ℃下的富集丰度明显高于20 ℃下的富集丰度（图3B~3I）。结果表明，转录因子PIF4与SAUR1~SAUR4启动子区中含有E-box的某些部分结合，而且高温增强了转录因子PIF4对这些区域的结合。

2.2.3　双荧光素酶报告基因试验中转录因子PIF4促进SAURs表达分析

为了进一步验证PIF4在转录水平上对SAUR1~SAUR4的调控，使用烟草叶片进行双荧光素酶报告基因试验。共表达pSAUR1：LUC和P35S：PIF4的烟草叶片中LUC报告基因表达量明显高于共表达pSAUR1：LUC和空载体的烟草叶片，该趋势在SAUR2p、SAUR3p和SAUR4p这3个启动子中也存在，进一步说明了转录因子PIF4具有促进SAUR1~SAUR4转录的能力（图4）。同时，平行试验结果表明，使用pSAUR1：LUC（mut）（PIF4结合区域的E-box被突变）替换pSAUR1：LUC后，p35S：PIF4对报告基因表达的促进作用基本消失，这种趋势在另外3个被突变的启动子中同样存在，表明这些E-box序列是PIF4促进SAUR1~SAUR4表达所必需的（图4）。综合图2~图4的结果说明，高温通过转录因子PIF4直接促进SAUR1~SAUR4基因的转录，这种促进可以通过增强PIF4与SAUR1~SAUR4基因启动子区的结合来实现。

2.3　 SAUR1和PIF4在热形态建成信号转导通路中的遗传学关系分析

为了进一步探究PIF4与SAURs的上下游关系，通过构建SAUR1 ox 1-3/Col-0、SAUR1 ox 2-12/pif4和SAUR1 ox 2-17/pif4过表达植物，统计过表达植物的热形态建成表型，分析SAUR1和PIF4的遗传学关系。在20 ℃下SAUR1 ox 1-3/Col-0比Col-0的下胚轴长，但比29 ℃下Col-0下胚轴短（图5A~5B），说明在常温中增加SAUR1的表达，使植物部分地启动为适应温和高温而发生的下胚轴伸长。在29 ℃条件下，过表达SAUR1并未使Col-0的下胚轴更长（图5A~5B）。这可能是因为高温条件下Col-0幼苗中SAUR1的表达量已经很高，在此基础上继续增加SAUR1的表达量已经无法再进一步 促进下胚轴伸长。在这2种温度条件下SAUR1 ox 2-12/pif4和SAUR1 ox 2-17/pif4的下胚轴均长于pif4，并且过表达SAUR1使温和高温下pif4的下胚轴长度基本与Col-0持平（图5A~5B）。结果表明，在热形态建成信号转导通路中SAUR1处于PIF4的下游。

2.4　PIF4通过生长素信号转导通路调控SAURs表达的结果

为了检测PIF4是否能够越过生长素信号转导通路直接调控SAURs的转录，通过构建35S-PIF4/shy2-3植物在增强PIF4的同时阻断生长素信号转导通路。其中35S-PIF4指PIF4被超量表达，shy2-3指AUX/IAA被增强。基因表达试验结果表明，在20 ℃条件下，shy2-3植株中SAUR1~SAUR4的表达量低于野生型，而35S-PIF4植株中SAUR1~ SAUR4的表达量高于野生型植株（图6），说明AUX/IAA抑制而PIF4促进SAUR1~SAUR4基因表达。当把shy2-3引入到35S-PIF4中后，35S-PIF4对SAUR1~SAUR4的促进作用被shy2-3强烈地抑制了（图6），说明在PIF4促进SAUR1~SAUR4的表达过程中，需要生长素信号转导通路中AUX/IAA及其下游的信号转导因子ARFs，或两者中的一个。

3 讨论

SAUR基因家族是生长素酸生长中使细胞壁酸化的重要成员，在促进细胞膨大的过程中发挥着重要作用。然而，转录因子PIF4通过生长素信号转导途径调控SAUR基因家族的信号转导通路步骤较多^［6-7］，反应速度较慢。本研究发现，转录因子PIF4能够绕过生长素信号转导途径，直接促进SAUR1、SAUR2、SAUR3和SAUR4的转录。这一调控过程具有加快植物应答速度的作用，从而提高植物适应高温环境的能力。

根据前人的研究成果，本研究总结PIF4调控SAURs主要包括以下几个步骤（图7）：（1）PIF4促进生长素合成基因YUC8的转录；（2）YUC8通过促进生长素的合成来提高植物体内生长素的含量；（3）生长素通过与生长素受体结合来抑制AUX/IAA蛋白；（4）被抑制的AUX/IAA蛋白可能通过减弱对转录因子ARFs的抑制来促进SAURs基因的转录。这一信号转导通路步骤较多，因此应答高温的速度也会较慢。但是此通路也有优点，即每一个信号转导步骤都会将信号强度放大，较多的步骤就导致信号被放大的程度也较大，最终就会强烈地促进SAURs的转录。本研究发现的转录因子PIF4直接促进SAURs转录的步骤很少，所以信号转导的速度较快。这一较短的信号转导通路弥补了上述长信号转导通路的缺点。但这个短通路因步骤很少，导致信号放大的程度较低，所以促进SAURs基因转录的能力较弱。综上所述，这一长一短信号转导通路相互取长补短互为补充，使植物在应答高温的过程中兼顾了信号转导的速度和强度，从而提高了植物适应高温的能力。

本研究结果表明，转录因子PIF4在调控SAURs的过程中依然需要生长素信号转导通路（图6），这看似与上述分析产生了矛盾，实则不然。前人^［19］的研究表明，PIF4与ARF6相互依赖地促进大量细胞伸长基因的转录，二者缺失任意一个都会使另一个丧失促进转录的功能。因此，本研究中生长素信号转导通路的阻断（图6），很可能是通过抑制ARF6的活性，才使PIF4丧失了促进SAUR1~SAUR4转录的能力。有研究^［19］表明，在ARF6水平不变的情况下，提高PIF4的水平就能够增强二者调控基因表达的能力。因此，转录因子PIF4就具有了提高生长素敏感性的能力，即在生长素水平不变的情况下依然能够增强生长素对植物的调控能力^［19］。在高温促进生长素含量上升的信号还未传递到ARF6的时段，转录因子PIF4能够招募到ARF6并与之配合来提高生长素的敏感性，从而增强细胞伸长基因的转录。综上所述，转录因子PIF4依然能够绕过生长素合成和生长素信号转导通路的大量信号转导步骤，以实现对SAUR1~SAUR4转录的快速调控。植物中的各种信号转导通路间并不是泾渭分明，而是相互缠绕交织的。因此，转录因子PIF4在调控SAUR1~ SAUR4的过程中，需要生长素信号转导通路中的某些成分参与也是一种正常的情况。

一般情况下，信号转导通路中下游基因的调控路径都是很长的，这就导致调控它们的速度较慢，从而拖慢了生物体的反应速度。因此，生物体需要进化出一些信号转导“捷径”，以提高调控下游基因的速度。SAUR基因家族是促进高温诱导的下胚轴伸长的下游基因^［10］，目前已知的调控通路一般都比较长。本研究发现了一条促进SAUR1~SAUR4转录的短信号转导通路，但是仅有促进的调控通路是远远不够的。本研究猜测很有可能还存在着抑制SAUR1~SAUR4转录的短信号转导通路。此外，还可能存在着其他促进SAUR1~ SAUR4转录的短信号转导通路。本研究通过探索调控热形态建成下游基因的信号转导“捷径”，进一步丰富了对热形态建成信号转导通路的理解，同时也为全球变暖条件下农作物抗热育种提供潜在的理论依据。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31600220)