白桦BpGRFs基因鉴定与功能初步分析

Identification and Preliminary Functional Analysis of the BpGRFs Gene in Betula Platyphylla

摘要

生长调节因子（GROWTH-REGULATING FACTOR，GRF）是一种植物中广泛存在的特异性转录因子，在植物的生长发育和胁迫响应过程中发挥着重要作用。该研究对白桦（Betula platyphylla）GRF基因家族进行生物信息学分析发现，白桦中包含9个GRF基因家族成员，均具有保守的WRC和QLQ结构域，启动子顺式作用元件预测分析发现，BpGRFs家族基因的启动子区域包含丰富的响应生长发育、激素代谢和胁迫反应等的相关元件。qRT-PCR结果表明，BpGRF4在白桦的各组织中均呈现高水平表达，进而通过农杆菌介导法获得了白桦过表达BpGRF4株系（OE-1、OE-2、OE-3），用以探究BpGRF4在白桦发育过程中的作用，过表达BpGRF4株系在株高、地径、节间长度、分枝长度均显著提升。另外，OE-3株系的皮层、韧皮部和髓心面积显著增大，叶片表皮细胞较野生型增大约51.6%。综上，过表达BpGRF4的白桦植株生长发育受到了积极调控作用，该结果为解析GRF基因家族在白桦生长发育过程中发挥的功能提供了一定理论依据。

Abstract

GROWTH-REGULATING FACTOR（GRF） is a specific transcription factor widely found in plants， which plays an important role in plant growth and development and stress response. In this study， bioinformatics analysis of the birch（Betula platyphylla） GRF gene family revealed that the birch reference genome contained nine GRF gene family members with conserved WRC and QLQ structural domains， and prediction analysis of promoter cis-acting elements in the BpGRFs family genes revealed that it contained abundant elements related to growth and development， hormone metabolism and stress response. The qRT-PCR results showed that BpGRF4 was highly expressed in all tissues of birch， and Agrobacterium-mediated method was used to obtain birch overexpressing BpGRF4 lines（OE-1，OE-2，OE-3） and the role of BpGRF4 in the birch development was explored， and the BpGRF4 overexpression lines were significantly elevated in plant height， diameter of the ground， internode length， and branching length respectively. In addition， the area of cortex， phloem and core of OE-3 line were significantly increased， and the leaf epidermal cells were about 51.6% larger than that of the wild type. In conclusion， the growth and development of birch overexpressed BpGRF4 were positively regulated， which provided the theoretical basis for clarifying the GRF gene family function in the growth and development of birch.

Graphical abstract

关键词

白桦 / 生长调节因子 / 生物信息学 / 生长发育

Key words

birch / GRF / bioinformatics / growth and development

生长调节因子（GROWTH-REGULATING FACTOR，GRF）是植物体中广泛存在的特异性转录因子，GRF基因家族成员包含2个保守的结构域：参与DNA结合的WRC结构域和参与蛋白质间相互作用的QLQ结构域^［1-2］。GRF基因在植物的株型改良、形态建成、器官发生及胁迫响应等多种生理过程中起到重要的调控作用^［3］。近年来，有关GRF基因在模式植物中的功能研究已经取得了显著进展。有研究^［4］表明，GRF基因是植物逆境胁迫应答反应过程中的关键调控因子，AtGRF7通过抑制胁迫响应基因DREB2A（DEHYDRATION-RESPONSIVE ELEMENT BINDING PROTEIN2A）的表达，从而在正常环境条件下抑制植株的生长。在烟草（Nicotiana tabacum）、棉花（Gossypium hirsutum）及西伯利亚剪股颖（Agrostis stolonifera）等多种植物中提高GRF基因的表达可以有效增强植株耐盐性^［5-7］。除此之外，GRF基因还参与植物生长发育的各个过程，如拟南芥（Arabidopsis thaliana）中过表达AtGRF2或AtGRF3可增强细胞的增殖能力，进而产生较大的叶片^［8-10］，在此基础上多项研究^［11-13］进一步指出GRF基因在拟南芥营养生长时期，功能冗余对叶片生长起促进作用。更为重要的是GRF基因还参与协调植物的发育与抗性之间的平衡关系，如水稻（Oryza sativa）中GRF基因的差异表达通过平衡生长与对稻瘟病的抗性从而消除了水稻抗病育种中的适应性成本，加速育种进程^［14］。

白桦（Betula platyphylla）是桦木科（Betulaceae）桦木属（Betula）的阔叶落叶硬木树种，广泛分布在我国的东北、华北、西北及西南地区^［15］。白桦具有较强的天然更新能力^［16］，可以单独形成白桦纯林，也可以与其他阔叶树种或针叶树种形成混交林，是天然森林演替过程中的主要先锋树种^［17］。同时，白桦还具有非常重要的药用价值，树皮和树汁中存在多种药用成分，可在临床上参与多种疾病的治疗^［18］。白桦对涵养水源、提升土壤肥力、固碳释氧、平衡生态系统及维持物种多样性具有重要意义^［19］。

本研究通过生物信息学系统分析了白桦GRF基因家族，结合分子生物学、遗传学和转基因技术，探讨BpGRF基因在白桦生长发育过程中的作用，通过鉴定基因成员、分析基因结构和染色体分布、构建系统发育树、分析蛋白质功能域、分析启动子顺式作用元件及检测基因表达量，揭示BpGRF基因家族的多样性和复杂性。进一步在白桦中过表达BpGRF4基因证明其促进白桦的营养生长。研究结果可为白桦GRF转录因子家族成员功能分析、白桦优良品种培育和分子辅助育种提供研究基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1　试验材料

试验所用种子来源于东北林业大学白桦强化种子园（45.766 2°N，126.624 7°E），通过白桦遗传转化获得过表达株系。后续采用1年生的野生型实生白桦苗和过表达BpGRF4白桦OE-1、OE-2、OE-3株系为试验材料，每个株系设置5株作为生物学重复。

1.2　试验方法

1.2.1　白桦BpGRF基因家族成员鉴定

从转录因子数据库PlantTFDB（http：//planttfdb.gao-lab.org/）下载拟南芥GRF家族蛋白序列。从Phytozome数据库（https：//phytozome.jgi.doe.gov/）下载白桦蛋白数据文件。使用TBtools软件^［20］将拟南芥GRF蛋白序列在白桦蛋白数据库比对，获取E-value<e^-5相似序列，将得到的结果筛除不包含完整WRC和QLQ结构域的序列。使用在线分析软件expasy（https：//web.expasy.org/protparam/）分析白桦GRF家族蛋白的氨基酸数目、相对分子质量、等电点及总平均亲水性。利用在线分析网站http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/预测白桦GRF家族蛋白亚细胞定位。

1.2.2　白桦BpGRF基因家族系统发育分析

从转录因子数据库PlantTFDB下载拟南芥、水稻、大豆（Glycine max）、玉米（Zea mays）、毛果杨（Populus trichocarpa） GRF家族蛋白序列。使用MEGA11.0对6个物种的GRF基因家族构建系统发育进化树，进行多序列比对，将比对结果在MODELS进行合适的模型预测，选择最合适的模型用最大似然法进行系统发育进化树构建。将生成的进化树导入在线网站iTOL（https：//itol.embl.de/）进行可视化。

1.2.3　白桦BpGRF基因家族保守结构域和基因结构分析

使用TBtools软件进行白桦GRF基因家族蛋白序列比对，得到结果，将保守结构域标注。从白桦基因组注释文件GFF中下载白桦GRF基因位置信息，使用TBtools中Visualize Gene Strcture（from GTF/GFF3 File）程序将白桦GRF基因结构可视化。

1.2.4　白桦BpGRF启动子顺式作用元件分析

获取9个白桦GRF基因起始密码子上游2 000 bp序列作为白桦GRF基因启动子序列。利用在线分析网站PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析启动子进行顺式作用元件，使用TBtools将结果可视化。

1.2.5　白桦BpGRF基因家族的组织表达特异性分析

使用康为世纪植物RNA提取试剂盒（DNase I）提取野生型白桦根、茎、叶的总RNA，使用Takara PrimeScript™ RT reagent Kit进行cDNA的反转录。使用BpTubulin基因为内参基因，根据cDNA序列信息设计引物（表1），以cDNA为模板进行qRT-PCR，使用2^-ΔΔCt公式计算基因的相对表达量^［21］。

1.2.6　遗传转化方法

为了过表达BpGRF4，使用上游引物ATGGATTTTGGGGTAGTGGGTT、下游引物TTACAGGGATGGAATTGAGGAACTT将BpGRF4基因全长克隆，使用T4连接酶将基因片段连接到pCAMBIA3301载体NocⅠ酶切位点上构建过表达载体。使用农杆菌（Agrobacterium）介导的白桦合子胚遗传转化法进行遗传转化获得转基因材料^［22］，以Basta为选择试剂，筛选转基因阳性植物。

1.2.7　石蜡切片

取野生型和OE-3转基因植株的中部茎段，将收集的茎段浸泡在FAA固定液（45%乙醇，6%乙酸，5%甲醛）中固定，将浸泡在FAA固定液的茎段放在冰盒中抽真空30 min。每30 min更换固定液直至样品沉于瓶底，最后将茎段置于冰上摇晃过夜。依次使用体积分数50%、70%、85%、95%乙醇对茎段进行梯度脱水。使用V（二甲苯）∶V（乙醇）=1∶1混合试剂对茎段进行透明化处理。随后于烘箱中60 ℃条件下将茎段浸于融化的蜡中，每天更换2次石蜡。之后进行包埋和切片机切片，二甲苯溶解石蜡后使用甲苯胺蓝（0.1%）染色，将浮色冲洗干净后使用中性树脂进行封片制成石蜡切片。最后使用光学显微镜（Zeiss，德国）采集图像。

1.2.8　扫描电镜

取野生型和OE-3转基因植株的第6片成熟叶片浸于戊二醛（2.5%）中保存，然后将样品置于50%乙醇中15 min，依次使用体积分数70%、80%、90%、95%、100%乙醇对样品进行脱水处理，其中处理需脱水2次。将样品置于临界点干燥器中，使用二氧化碳作为干燥介质进行临界点干燥。将干燥后的样品放入喷金机将铂均匀的喷涂于样品表面，之后使用扫描电子显微镜（Thermo Scientific，美国）采集叶片表皮细胞图像。

1.3　数据处理

使用Graph Pad Prism软件，采用Student’s t-test方法对各组数据进行分析。

2 结果与分析

2.1　白桦BpGRF基因家族生物信息学分析

2.1.1　白桦BpGRF基因家族鉴定及理化性质分析

基于拟南芥GRF蛋白序列在白桦蛋白数据库中进行同源序列比对，共鉴定得到9个白桦GRF基因，依次命名为BpGRF1~BpGRF9（表2）。对白桦GRF基因家族进行蛋白质理化性质分析，结果表明：9个白桦GRF基因的蛋白氨基酸数目为316~606个氨基酸；相对分子质量为35 993.60~ 65 788.05 Da；等电点为6.28~9.57，等电点分析表明BpGRF4（pI=6.52）、BpGRF7（pI=6.28）2个蛋白为酸性蛋白，其余7个蛋白均为碱性蛋白；所有的BpGRFs均为亲水蛋白；亚细胞定位预测结果表明，所有的BpGRFs均定位在细胞核当中。

2.1.2　白桦BpGRF基因家族系统发育进化树分析

为了明确白桦BpGRF基因家族的系统发育进化关系，将白桦、水稻、拟南芥、大豆、玉米、毛果杨共6个物种的GRF蛋白序列进行比对并构建系统发育进化树（图1A）。根据进化树分枝将GRF基因分为A、B、C、D、E、F 6组，除D组外，剩余5组中均有白桦的GRF分布。与水稻、拟南芥、大豆相比，白桦的GRF基因在进化过程中和毛果杨之间分化程度更小，说明白桦GRF与毛果杨GRF具有更为相近的亲缘关系。

2.1.3　白桦BpGRF基因家族保守结构域分析和基因结构分析

通过对白桦中的9个GRFs蛋白序列进行 多序列比对分析发现，BpGRFs蛋白均包含完整 的QLQ结构域和WRC结构域（图1B）。对BpGRF基因家族进行基因结构分析发现（图1C），所有 的BpGRF基因结构比较相似，由4个外显子和3个内含子构成，除了BpGRF8的基因序列长度超过 4 000 bp外，其余8个GRF基因长度均在1 245~ 3 137 bp。

2.1.4　白桦BpGRF基因家族启动子顺式作用元件分析

为了研究白桦BpGRF对白桦生长发育的调控，对BpGRF家族启动子区域的顺式作用元件进行预测分析。结果发现：在每个BpGRF启动子上都存在多个不同功能的顺式作用元件（图1D）。顺式作用元件主要分为响应不同逆境胁迫反应的元件、响应不同激素反应的元件和响应光反应的元件等。逆境胁迫反应的元件主要包括防御/应激响应元件、参与干旱胁迫响应MYB结合位点元件、参与低温胁迫的元件；响应不同激素反应的元件包括响应水杨酸、脱落酸、赤霉素和茉莉酸甲酯的元件；BpGRF启动子中的光反应元件包括光反应元件、光响应元件、光调控元件等。除此之外，还存在一些厌氧诱导反应元件、昼夜节律反应元件、分生组织相关反应元件、玉米醇溶蛋白代谢调控的顺式作用元件等。

2.2　白桦BpGRF基因家族表达模式分析

为了研究BpGRFs在白桦生长发育中的作用及各在组织中的表达模式，本研究检测了白桦不同组织部位（根、茎、叶）中所有GRF基因的相对表达量（图2）。结果表明：BpGRF1在根、茎、叶当中均不表达；BpGRF2、BpGRF3、BpGRF5、BpGRF7和BpGRF8组织特异性表达模式相似，在根中仅有极低的表达量，在茎和叶中高表达。BpGRF4、BpGRF6和BpGRF9在根、茎和叶中表达，并且在茎和叶中表达量高于根中表达量；值得注意的是，BpGRF4在根、茎、叶中均具有高的表达量，据此推测BpGRF4基因可能在白桦的营养发育阶段发挥重要的作用。

2.3　过表达BpGRF4转基因株系的获得及表型分析

2.3.1　过表达BpGRF4转基因株系的获得

为探究BpGRF4基因影响白桦营养生长的过程，以白桦cDNA为模板克隆BpGRF4基因全长 1 803 bp，并使用T4连接酶将目的基因片段与线性化载体pCAMBIA3301连接，成功构建过表达BpGRF4载体。通过农杆菌介导的白桦合子胚遗传转化方法进行遗传转化，得到OE-1、OE-2、OE-3共3个过表达白桦转基因株系。

2.3.2　OE-3转基因株系表型统计结果

检测1年生野生型和1年生过表达植株中BpGRF4的表达量（图3A），结果显示，相较于野生型植株，OE-1、OE-2、OE-3株系中BpGRF4基因的表达量均显著上调，其中OE-3株系表达量提升最为显著，因此，选取1年生的OE-3株系进行后续研究。通过野生型与过表达株系OE-3白桦表型观测发现，OE-3株系长势显著优于野生型植株（图3B）。选取生长健康的野生型植株和OE-3转基因株系各5株进行生长调查统计。结果发现：OE-3株系的株高较野生型有显著提升（图3C）；野生型与过表达株系的节间数量没有显著差异，但由上至下的前10个节间的平均长度提升了约50%（图3D~3E）；过表达株系OE-3较野生型株系的分枝数量有所增加，但增加的程度并不显著（图3F）。进一步统计各分枝的长度，结果显示，OE-3转基因株系的植株分枝长度显著高于野生型分枝（图3G）。根据表型统计结果分析认为，BpGRF4通过增加节间长度和分枝数量来促进白桦植株的生长发育。

2.3.3　OE-3转基因株系茎表型分析

为了进一步研究BpGRF4对白桦茎生长发育的影响，针对茎横向生长展开调查。比较野生型与OE-3转基因株系的地径（图4C），发现OE-3转基因株系的地径显著高于野生型株系。野生型植株和OE-3转基因植株的中部茎段采用石蜡切片的方式对白桦茎进行组织细胞学观察（图4A~4B）。将茎横切图分为皮层、韧皮部、木质部和髓心4个部分（图4D~4H），分别统计4个部分的面积。统计结果显示，OE-3转基因植株的茎横截面积、皮层面积、韧皮部面积、髓心面积均显著高于野生型株系，较野生型株系提升分别为29.7%、60.1%、35.2%、147.2%。OE-3转基因植株与野生型植株木质部面积没有发生显著变化。

2.3.4　OE-3转基因株系成熟叶片表型分析

本研究观察到OE-3转基因株系的叶片相较于野生型植株叶片在大小方面发生了变化（图5A）。进一步测量OE-3转基因株系和野生型株系成熟叶片的叶面积、叶片长度、叶片宽度并进行统计分析（图5C~5E），结果显示，OE-3转基因植株的叶面积相较野生型增加了约30.1%，叶片长度相较野生型增加了约24.2%，叶片宽度相较野生型增加了约13.6%。为了研究BpGRF4在细胞层面对叶片大小的影响，选取野生型株系与OE-3株系植株的第6片成熟叶片进行扫描电镜观察（图5B），观察到白桦表皮细胞呈现不规则形状。进一步统计叶片表层细胞大小结果显示，OE-3转基因株系比野生型株系的叶片表皮细胞显著增大（图5F），增大约51.6%。综上所述，BpGRF4通过促进叶片表皮细胞增大，使OE-3株系的成熟叶片面积大于野生型株系的成熟叶片面积。

3 讨论

白桦是一种适应性极强、耐寒的落叶阔叶树种，常用于家具和工艺品制造、城市绿化及食品药品加工^［23］。近5年来，白桦分子育种发展较为迅速，已经在白桦生长发育和抗逆性等方面发掘到多个相关基因，如过表达在茎中高表达的BpEXPA1（Expansin A）可促进皮层细胞膨大，进而通过扩大皮层细胞面积和增加层数来影响白桦茎发育^［24］；过表达BpmiR156白桦表现出发育延迟、矮化、叶表皮毛增加、叶基角增大和茎弯曲改变等性状^［25］；BplncSIR1是BpNAC2（encoding NAC domain-containing protein 2）的调控因子，能诱导BpNAC2在盐胁迫下表达，激活的BpNAC2能加速白桦生长并提高耐盐性^［26］；过表达BpHOX2（encoding a HD-Zip I family protein）能显著提高白桦渗透胁迫的耐受性，而敲除BpHOX2则会提高对渗透胁迫的敏感性^［27］。综上所述，白桦分子育种研究成果日渐丰富，但目前关于BpGRF基因家族基因改变白桦生长发育表型的研究鲜有报道。

GRF基因家族是一类植物中特有的高度保守的转录因子家族^［28］，研究表明，GRF基因在植物生长发育和胁迫响应方面发挥着重要的作用^［29-31］，更为重要的是GRF基因还在一定程度上平衡植物生长发育和防御反应相互拮抗的现象，使植物在逆境胁迫下可以正常生长^［32］。本研究首次鉴定出了9个均包含完整WRC和QLQ保守结构域的BpGRF基因家族成员，通过系统发育进化树分析可知，9个BpGRF可以分到5个分支，A分支中AT2G45480.1（AtGRF9）、LOC_Os02g45570.1（OsGRF10）负调控拟南芥和水稻的生长发育^［33-34］；B分支中AT5G53660.1（AtGRF7）、AT4G24150.1（AtGRF8）与水稻花生长发育相关^［35］；C分支中LOC_Os11g35030（OsGRF8）、LOC_Os12g29980（OsGRF7）、AT2G22840（AtGRF1）、AT4G37740（AtGRF2）都可以促进叶片生长发育^［3，36］；E分支中LOC_Os04g51190.1（OsGRF3）、LOC_Os06g02560.1（OsGRF5）都参与水稻花序的形成^［33］；F分支中AT3G13960.1（AtGRF5）、AT2G06200.1（AtGRF6）调控芽顶端分生组织的生长发育^［33］。进化树中不同分支上的基因可能存在一定的功能差异，将BpGRFs划分不同的分支可以参考分支中其他基因功能对BpGRF功能进行预测。顺式作用元件是基因表达过程中重要的调控因子，通过响应生长发育及环境变化过程中的信号因子，调节相关基因的表达^［37］。已有研究^［38］表明，基因顺式作用元件的密度与其表达受到的调控之间存在显著的关联性，在BpGRF家族基因的启动子区域发现与多种生长发育有关的顺式作用元件，这在一定程度上说明了BpGRF家族成员具有与生长发育相关的功能。基因表达模式分析为确定基因功能提供了重要的可参考支撑数据^［39］，OsbHLH98（basic helix-loop-helix98）在水稻叶枕特异性高表达调控水稻叶夹角^［40］；在花药特异表达的过氧化物酶基因OsNUP1（no ubisch body and pollen grain 1）缺失表现为雄性不育^［41］；敲除在马铃薯（Solanum tuberosum）块茎中特异性表达的StbHLH93（basic helix-loop-helix93）后马铃薯块茎数量和大小与野生型马铃薯存在显著差异^［42］。本研究对白桦根、茎、叶组织部位进行BpGRFs基因表达模式分析，qRT-PCR结果显示，BpGRF4在各个组织中均呈现出显著表达，说明BpGRF4可能在白桦植株发育过程中起到一定积极促进作用。

BpGRF4过表达白桦株系比野生型株系长势更优，BpGRF4通过增加节间长度来促进白桦株高增长。类似的结果在柳枝稷（Panicum virgatum）中也被发现，在柳枝稷中过表达PvGRF9可以显著增加节间长度进而增加株高^［43］。叶面积是决定植物生产力的重要参数，植物的叶面积直接影响光合作用的表面积^［44］，在杨树中PagGRF12a和PagGRF12b通过促进细胞增殖和扩展来正向调节叶片大小^［45］。本研究在白桦中过表达BpGRF4，增加了成熟叶片的叶长和叶面积，对成熟叶片进行电镜扫描试验结果显示，OE-3株系叶片表皮细胞面积显著增加，这表明在白桦中过表达BpGRF4基因可能是通过促进叶片表皮细胞面积的增大使叶片面积增大。综上所述，过表达BpGRF4在白桦叶片中促进叶片表皮细胞面积显著增加，进而引起白桦叶片表面积显著增大，叶面积的增大可能会使植物积累更多的生物量从而增加白桦株高。

GRF基因在植物的生长、发育和应对环境胁迫过程中起着关键作用，尤其是在细胞增殖、细胞扩展及组织分化等过程中^［2］。GRF基因表达在植物的幼苗阶段显著增强，促进了细胞的快速分裂和生长，从而提高了植株的生长速率^［46］。先前的研究^［47］表明，在蓖麻（Ricinus communis）中RcGRF4通过介导生长素合成来控制种皮细胞增殖和增大，进而提高蓖麻产量，本研究中BpGRF4促进白桦叶片细胞的增大进而增加叶片面积的结论与之一致，均证明了GRF基因在影响细胞扩展过程中的作用。除此之外，通过进化树分析发现，BpGRF4与LOC_Os11g35030（OsGRF8）、LOC_Os12g29980（OsGRF7）、AT2G22840（AtGRF1）、AT4G37740（AtGRF2）处于同一分支，拥有较近的亲缘关系。与野生型植株相比，过量表达AtGRF1和AtGRF2会导致叶片和子叶变大^［3］。还有研究^［36］表明，水稻中OsGRF7/8通过调控叶片分裂区大小最终决定叶片的长度。这些结果表明：同一分支的不同GRF基因家族成员在功能上具有较强的保守性且位于BpGRF4分支的GRF基因家族成员可能在促进植物生长发育方面扮演着重要角色。BpGRF3则被证明通过调控下游BpGRP1（glycine-rich RNA-binding protein）赋予了白桦耐盐性，但并没有影响植株的生长发育^［48］。这说明GRF基因家族成员功能的多样性。总的来说，GRF基因通过调控细胞增殖、细胞扩展及对环境胁迫的响应，显著影响植物的生长发育过程。进一步揭示GRF基因的作用机制，可以作为未来的研究方向。

本研究通过生物信息学鉴定出9个白桦GRF基因家族成员，并通过生物信息学分析发现GRF基因家族的丰富性和对生长发育调控的多样性。qRT-PCR结果表明，BpGRF4基因在茎和叶中的表达水平高于其他器官中GRF基因。进一步对BpGRF4的过表达株系调查分析发现，BpGRF4基因对白桦茎、叶的不同组织和细胞的生长发育起积极的促进作用。

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基金资助

中国博士后科学基金第75批面上项目(2024M750382)