不同初生休眠类型林木种子适宜萌发温度及其对热休眠诱导的响应

Optimal Germination Temperature of Tree Seeds with Different Primary Dormancy Types and Their Responses to Thermal Dormancy Induction

摘要

为研究不同初生休眠类型林木种子的适宜萌发温度及其对热休眠诱导的响应，以3种初生休眠类型（非休眠、物理休眠和生理休眠）的9个树种解除休眠后的种子为材料，分别在5、10、15、20、25、30、35 ℃的恒温下进行萌发试验，根据萌发表现确定不同树种的适宜萌发温度；在此基础上，在25、30、35 ℃下对种子进行高温培养并转移至适宜萌发温度进行14 d萌发试验，根据种子萌发表现比较不同初生休眠类型种子对热休眠诱导的响应规律。结果表明：不同初生休眠类型种子的适宜萌发温度表现出一定差异，非休眠种子（红皮云杉（Picea koraiensis）、华北落叶松（Larix principis-rupprechtii）、黑松（Pinus thunbergii））的适宜萌发温度为10~25 ℃，物理休眠种子（山皂荚（Gleditsia japonica）、刺槐（Robinia pseudoacacia）、紫穗槐（Amorpha fruticosa））的适宜萌发温度为10~35 ℃，生理休眠种子（油松（Pinus tabuliformis）、花曲柳（Fraxinus rhynchophylla）、秋子梨（Pyrus ussuriensis））的适宜萌发温度为5~30 ℃；高温抑制大部分种子萌发，仅生理休眠的秋子梨种子在高温下进入热休眠（休眠率80%~86%），而生理休眠的其他（油松和花曲柳）种子表现出较高的死亡率（46%~69%），非休眠种子表现出更高的死亡率（56%~100%），物理休眠种子表现为低死亡率（24%~64%），物理休眠种子在25~35 ℃高温下种子萌发率为36%~76%。非休眠和物理休眠种子在高温下萌发未进入热休眠，生理休眠种子在高温下是否进入热休眠、热休眠状态表现不一致。

Abstract

In order to clarify the optimal germination temperature conditions of tree seeds with different primary dormancy types and their responses to thermal dormancy induction， the seeds of nine different tree species with three primary dormancy types （non-dormancy， physical dormancy and physiological dormancy） were used as materials for germination tests at 5， 10， 15， 20， 25， 30 and 35 ℃， respectively， and an appropriate germination temperature was determined according to seed germination performance. On this basis， the seeds were cultured at 25， 30 and 35 ℃ and transferred to the appropriate germination temperature for 14 days. The response of different primary dormancy types of seeds to thermal dormancy induction was compared according to seed germination performance. The results showed certain differences in an optimal germination temperature of seeds with different primary dormancy types. The optimal germination temperature for non-dormant seeds （Picea koraiensis， Larix principis-rupprechtii， and Pinus thunbergii） was in a range of 10-25 ℃， for physically dormant seeds （Gleditsia japonica， Robinia pseudoacacia， and Amorpha fruticosa） was in a range of 10-35 ℃， for physiologically dormant seeds （Pinus tabuliformis， Fraxinus rhynchophylla， and Pyrus ussuriensis） was in a range of 5-30 ℃. High temperatures inhibited germination in most seeds. Only the physiologically dormant P. ussuriensis seeds entered thermal dormancy under high temperatures （with dormancy rates of 80%-86%）， while the other physiologically dormant seeds （P. tabuliformis and F. rhynchophylla） had higher mortality rates （46%-69%）. Non-dormant seeds had higher mortality rates （56%-100%）， while physically dormant seeds had lower mortality rates （24%-64%）. Physically dormant seeds had germination rates of 36%-76% at high temperatures of 25-35 ℃. Non-dormant and physically dormant seeds did not enter thermal dormancy under high temperatures， while the response of physiologically dormant seeds to thermal dormancy under high temperatures was inconsistent.

Graphical abstract

关键词

种子 / 初生休眠 / 休眠类型 / 萌发温度 / 热休眠

Key words

seed / primary dormancy / dormancy type / germination temperature / thermal dormancy

按照休眠发生的时间顺序，种子休眠（seed dormancy）可分为初生休眠（primary dormancy）和次生休眠（secondary dormancy）^［1］。初生休眠是种子在母体发育过程中形成的，按照休眠产生的原因可划分为生理休眠（physiological dormancy，PD）、形态休眠（morphological dormancy，MD）、形态生理休眠（morphophysiological dormancy，MPD）、物理休眠（physical dormancy，PY）和综合休眠（combined dormancy，PY+PD）5种类型^［2］。在成熟时缺乏初生休眠的种子为非休眠（non-dormancy，ND）种子，无需打破休眠即可萌发^［3］。次生休眠（又称二次休眠）是指原来非休眠或解除休眠后的种子，在经过高温、低水势、缺氧等不适宜环境条件诱导后再次进入休眠状态^［4］。初生休眠和次生休眠虽然在分类上有所区分，但二者本质上是种子应对环境变化的连续性表现，大多数具有浅生理休眠的种子在温度驱动下会经历从初生休眠到非休眠、再到次生休眠的动态转变，形成休眠循环^［5］。温度是驱动休眠循环的主要信号因子，适宜的温度可激活非休眠及解除初生休眠后种子的代谢活动，促进萌发并提高发芽率^［6］。不同种子的适宜萌发温度区间不同，对高温的耐受能力也不同。经高温诱导后，种子发芽率可能显著下降，有些种子会进入高温诱导的次生休眠（即热休眠）状态，此时即使再转移至适宜萌发温度，种子仍无法正常萌发。种子热休眠已在现有研究中受到广泛关注^［7］。在以往研究中发现，非休眠种子可以在高温诱导下进入热休眠^［8］，如莴苣（Lactuca sativa）^［9］和芹菜（Apium graveolens）^［10］种子。Soltani等^［11］以欧洲油菜（Brassica napus）种子为例，对初生休眠和次生休眠之间的关系进行了探讨，结果表明，只有具有一定程度初生休眠的欧洲油菜种子才能进入次生休眠。有研究^［12-13］进一步指出，只有生理休眠类型的种子才有进入次生休眠的能力，物理休眠和形态休眠因打破休眠不可逆，不会再次进入休眠循环和次生休眠状态^［14］。关于欧洲油菜^{［11，15-16］}和拟南芥（Arabidopsis thaliana）^［17-19］种子的研究都证明了具有生理休眠的种子更容易进入次生休眠，并发现PD休眠程度较深的种子具有较高的次生休眠诱导能力，支持了上述观点。然而，也有研究^［20］指出，物理休眠种子有再次进入休眠循环和次生休眠的能力，但这种现象尚未被广泛验证。因此，种子的不同初生休眠类型与次生休眠之间的关系尚未明确，有待进一步探索。

本研究以生理休眠、物理休眠和非休眠3类初生休眠类型共计9种林木种子为研究对象，通过比较解除初生休眠后的种子在不同温度下的萌发表现，探究以下2个问题：（1）不同初生休眠类型种子的适宜萌发温度；（2）有初生休眠特性的种子是否更容易诱导进入热休眠状态。研究结果可为丰富和完善种子休眠与萌发调控理论提供科学依据。

1 材料与方法

1.1　研究材料

选取北方地区9种生产中常见的林木种子作为研究对象，涵盖非休眠、物理休眠和生理休眠3类初生休眠类型。参照GB 2772—1999《林木种子检验规程》^［21］以称重法测定种子千粒质量，以TTC染色法测定种子生活力，以烘干法测定种子含水量，各林木种子基本信息详见表1。

1.2　研究方法

1.2.1　种子解除休眠处理

生理休眠种子。将浸种后的油松（清水浸种24 h）、花曲柳（清水浸种24 h）和秋子梨（500 mg·L^-1 GA₃浸种24 h）种子以质量分数0.5%的高锰酸钾消毒30 min后，流水洗净高锰酸钾溶液并沥干种子表面水分，置于5 ℃下（黑暗，湿度50%）进行裸层积^［22］处理，层积过程中，每天翻拌种子并补充水分。层积6周后解除秋子梨种子休眠，层积8周后解除花曲柳和油松种子休眠。

物理休眠种子。将山皂荚种子置于恒温水浴锅中，在70 ℃下水浴加热10 min之后使其自然冷却至室温，再浸泡24 h后取出种子并用流水冲洗^［23］。将刺槐和紫穗槐种子放入初始温度为75 ℃的热水中浸泡，待自然冷却。热水用量以浸没种子为准，浸泡24 h后取出种子并用流水冲洗^［24-25］。

1.2.2　种子萌发试验

将3种休眠类型的9种树种种子分别置于5、10、15、20、25、30、35 ℃的恒温条件（湿度50%，黑暗）。共设计63个处理，每个处理随机选取100粒种子分为4次重复，在垫有1层湿润滤纸的培养皿（直径=9 cm）中进行发芽试验。

按照GB 2772—1999《林木种子检验规程》^［21］的有关规定，每日观察并记录种子发芽情况，当种子的胚根突破种皮2 mm时记为种子萌发。当连续7 d无新种子萌发或培养时间达到30 d时，判定萌发试验结束。试验结束后，计算种子的发芽率（P_{\mathrm{G}}）和发芽指数（I_{\mathrm{G}}），种子发芽能力指标计算公式为

P_{\mathrm{G}}=\frac{N_{\mathrm{g}}}{N_{\mathrm{t}}}\times \mathrm{100}\%（1）

I_{\mathrm{G}}={\displaystyle \sum _{i=\mathrm{1}}^n}\frac{n_i}{t_i}（2）

式中：N_{\mathrm{g}}为发芽种子总数量；N_{\mathrm{t}}为供试种子总数量；n_i为第i天的发芽种子数量；t_i为第i天的时间；n为发芽的时间。

1.2.3　种子休眠率和死亡率计算

从25、30、35 ℃休眠诱导条件中取出后，将种子冲洗并转移到垫有湿润滤纸的新培养皿中，并在适宜温度下继续观察14 d，种子不再发芽。对未萌发的种子进行活力测定，种子活力染色采用TTC染色法。种子未发芽但经TTC染色法证明仍具生活力的种子即进入热休眠状态，记为种子休眠；种子未发芽并经TTC染色法证明失去生活力记为种子死亡。试验结束后，计算休眠率（P_{\mathrm{D}}）和死亡率（P_{\mathrm{M}}），公式为

P_{\mathrm{D}}=\frac{N_{\mathrm{d}}}{N_{\mathrm{t}}}\times \mathrm{100}\%（3）

P_{\mathrm{M}}=\frac{N_{\mathrm{m}}}{N_{\mathrm{t}}}\times \mathrm{100}\%（4）

式中：N_{\mathrm{d}}为未萌发但经TTC染色法证明仍具生活力的休眠种子数量；N_{\mathrm{m}}为未萌发并经TTC染色法证明失去生活力的死亡种子数量。

1.2.4　数据处理

使用Microsoft Excel 2016软件对数据进行整理；使用SPSS 19.0软件进行数据分析，进行单因素ANOVA分析，采用Duncan 法对不同温度下不同种子的萌发情况进行多重比较；使用基于Python 3.9.13的开源可视化工具matplotlib 3.6.0绘图。

2 结果与分析

2.1　不同初生休眠类型种子的适宜萌发温度

非休眠类型种子的适宜萌发温度区间为10~25 ℃，不同种子的最适萌发温度表现出一定的种间差异。红皮云杉种子的发芽率与发芽指数随着温度升高均先升高后降低，种子在10~20 ℃的发芽率为51%~65%，在15 ℃和20 ℃下种子发芽率和发芽指数显著高于其他温度处理（P<0.05），15 ℃下种子发芽率最高，即红皮云杉种子的适宜萌发温度为10~20 ℃，最适萌发温度为15 ℃。华北落叶松种子的发芽率与发芽指数随着温度升高均先升高后降低，25 ℃下达到峰值，显著高于其他处理（P<0.05），即华北落叶松种子的最适萌发温度为25 ℃。黑松种子的发芽率与发芽指数随着温度升高均先升高后降低，20 ℃下达到峰值，显著高于其他处理（P<0.05），即黑松种子的最适萌发温度为20 ℃（表2）。

物理休眠种子的适宜萌发温度为10~35 ℃，不同种子最适萌发温度均集中在15 ℃，不同种子间表现出一致性。山皂荚种子的发芽率与发芽指数随着温度升高均先升高后降低，种子在10~30 ℃的发芽率为65%~88%，在15 ℃的发芽率和发芽指数显著高于其他温度处理（P<0.05），即山皂荚种子的适宜萌发温度为10~30 ℃，最适萌发温度为15 ℃。刺槐种子的发芽率与发芽指数随着温度升高先升高后降低，种子在10~35 ℃的发芽率为61%~95%，发芽率和发芽指数在15 ℃达到峰值，显著高于其他处理（P<0.05），即刺槐种子的适宜萌发温度为10~35 ℃，最适萌发温度为15 ℃。紫穗槐种子的发芽率与发芽指数随着温度升高先升高后降低，种子在10~35 ℃的发芽率为46%~96%，发芽率和发芽指数在15 ℃达到峰值，显著高于其他处理（P<0.05），即紫穗槐种子的适宜萌发温度为10~35 ℃，最适萌发温度为15 ℃（表3）。

生理休眠种子的适宜萌发温度为5~30 ℃，不同种子的最适萌发温度具有较大的种间差异。油松种子的发芽率与发芽指数随着温度升高先升高后降低，种子在15~25 ℃的发芽率为69%~84%，在25 ℃发芽率和发芽指数最高，即油松种子的适宜萌发温度为15~25 ℃，最适萌发温度为25 ℃。花曲柳种子的发芽率与发芽指数随着温度升高先升高后降低，种子在20~30 ℃的发芽率为54%~88%，发芽率和发芽指数在25 ℃达到峰值，显著高于其他处理（P<0.05），即花曲柳种子的适宜萌发温度为20~30 ℃，最适萌发温度为25 ℃。秋子梨种子的发芽率与发芽指数随着温度升高显著降低（P<0.05），种子在5~10 ℃发芽率为62%~93%，发芽率和发芽指数在5 ℃达到峰值，显著高于其他处理（P<0.05），即秋子梨种子的适宜萌发温度为5~10 ℃，最适萌发温度为5 ℃（表4）。

2.2　不同初生休眠类型种子对热休眠诱导的响应

在高温诱导下，不同初生休眠类型种子的萌发表现存在差异，但均未表现出热抑制现象。非休眠种子在高温下大量死亡；物理休眠种子在高温下未进入热休眠状态，种子部分死亡但能维持一定的发芽率；生理休眠种子表现出较大的种间差异，秋子梨种子在高温诱导下进入热休眠，油松和花曲柳种子在高温下大量死亡。

非休眠类型种子在高温诱导条件下均未进入热休眠，随着温度升高，种子发芽率降低，死亡率升高，种子对高温的适应性较差。红皮云杉种子在25~35 ℃的高温下，死亡率为71%~100%，华北落叶松种子的最适萌发温度为25 ℃，在30 ℃和35 ℃的高温下种子死亡率分别为69%和100%，黑松种子在25~35 ℃的高温条件下萌发，死亡率为56%~99%（图1）。

物理休眠类型种子在高温诱导下均未进入热休眠，随着温度升高，种子死亡率升高，但仍可在高温下保持一定的发芽率。山皂荚种子在25~30 ℃高温下种子发芽率为65%~75%，且在35 ℃下仍能保持36%的发芽率。刺槐种子在25~35 ℃高温下发芽率为61%~76%，紫穗槐种子在25~35 ℃的高温下发芽率为46%~60%（图2）。

生理休眠类型种子在高温诱导下秋子梨种子进入热休眠，油松和花曲柳种子发芽率降低，死亡率升高。油松种子的最适萌发温度为25 ℃，在30 ℃和35 ℃的高温下死亡率分别为62%和69%，花曲柳种子的最适萌发温度为25 ℃，在30 ℃和35 ℃的高温下死亡率分别为46%和66%，油松和花曲柳种子在高温下萌发未进入热休眠状态。秋子梨种子在25~35 ℃高温下休眠率为80%~86%，种子在高温下萌发进入热休眠状态（图3）。

3 讨论与结论

种子萌发特性在很大程度上受其所处生态环境的影响，促使种子形成了不同初生休眠类型及其相应的温度响应特征。本研究中，非休眠类型种子（红皮云杉、华北落叶松、黑松）适宜萌发的温度为10~25 ℃，且不同树种间存在一定差异。非休眠类型种子多分布于降水稳定、无极端干旱期的湿润气候区域，这些区域水分供应充足，季节性变化相对较小，使得该类型植物的种子通常演化出快速萌发的策略，以便在短暂的适宜生长季节内迅速完成萌发和幼苗建立，从而在资源竞争中占据优势^［26］。这种适应性优势促使非休眠类型种子在裸子植物和被子植物的多个类群中独立演化，使其分布广泛且种类繁多^［27］。不同树种的萌发特性因长期适应差异化的生态环境而存在显著分化，可能导致种子萌发特性（如温度需求）存在一定差异。如本研究中红皮云杉^［28］、黑松^［29］和华北落叶松^［30］均天然分布于温带温度相对温和的地区，未经历极端高温的自然选择，因此，可能未进化出耐高温的适应性，在高温条件下易发生代谢紊乱和细胞损伤，导致种子死亡。本研究中，物理休眠类型种子（山皂荚、刺槐、紫穗槐）的适宜萌发温度为10~35 ℃，不同种子最适萌发温度均集中在15 ℃，表现出较高的一致性。物理休眠种子的萌发依赖于种皮的物理屏障被打破，这一结构在进化过程中是对特定环境的高度适应，例如，地中海的半日花科（Cistaceae）植物种皮坚硬，火灾可以破坏种皮的物理屏障，因此，夏季着火的时间决定了种子的发芽时间^［31］。这种对特定环境条件的依赖，限制了种子的分布范围，使物理休眠类型种子仅集中分布在部分植物类群中，同时也导致它们在萌发特性上表现出较高的一致性。目前，物理休眠类型种子仅存在于18个被子植物科的部分属中，其中，大多数为豆科植物^［32］。本研究中，物理休眠种子均为豆科树种，因此，表现出相对一致的萌发特性。物理休眠类型种子主要分布于具有显著环境波动或胁迫压力的气候带，演化与特定气候因子存在密切关联^［3］。本研究发现，高温抑制物理休眠种子的发芽率，但种子未完全死亡，仍能维持一定的发芽率。本研究中，物理休眠的山皂荚、刺槐和紫穗槐主要分布于温带和亚热带地区，常见于经历季节性高温干旱的生态环境中，种子坚硬的种皮能够在一定程度上抵御高温，减少对种胚的直接损伤，使其在面对短期高温胁迫时仍能保持一定的生存能力。本研究中，生理休眠类型种子（油松、花曲柳、秋子梨）的适宜萌发温度为5~30 ℃，且不同树种间表现出较大差异。生理休眠是温带种子库中最普遍的休眠形式，广泛分布于裸子植物和主要被子植物分支的种子中^［6］。生理休眠种子通过复杂的生理机制感知环境信号，从而调节萌发时间，使其能够在多变的环境中生存和繁衍。不同树种在长期进化过程中，根据各自所处的生态环境，逐渐形成了独特的生理休眠和萌发策略，这就导致了它们在萌发特性上存在较大差异^［3］。如本研究的油松主要分布于温带大陆性气候区域^［33］，该地区冬季寒冷干燥，夏季降水集中且高温天气持续时间短。由于该区域极端高温事件在自然条件下较为罕见（夏季平均气温通常低于30 ℃），油松种子在演化过程中可能未形成有效的高温防御机制，因此，当遭遇异常高温时，种子容易大量死亡。类似地，花曲柳种子主要分布于温带湿润及半湿润气候区域^［34］，原生境夏季林下温度通常低于30 ℃，缺乏高温选择压力，因此，对于高温的耐受性较弱，导致种子在高温条件下容易死亡。这一现象与油松的响应机制相似，反映了温带区域物种在异常高温条件下的脆弱性。秋子梨分布于寒温带过渡气候区^［35］，最适萌发温度较低（5 ℃），表明萌发通常发生在早春融雪后的低温窗口，以便在生长季种间竞争中占据优势。该区域夏季气温一般在18~27 ℃，25 ℃是较为常见的气温。本研究结果发现，秋子梨种子在25 ℃高温诱导下可进入热休眠，这表明秋子梨可能进化出以热休眠规避高温风险的机制，在适宜温度（如早春）优先萌发，而当外界温度超过萌发温度上限后，迅速进入休眠，以避免高温期间萌发失败或幼苗死亡。

本研究中，非休眠种子在高温胁迫诱导下均未进入次生休眠，但已有研究指出，某些非休眠种子（如莴苣^［9］和芹菜^［10］种子），在高温条件下能够进入热休眠。本研究中，非休眠类型种子均为松科种子，目前，未见松科种子进入热休眠的相关报道，因此，非休眠种子能否进入热休眠可能因物种而异。物理休眠的机制是由种皮的物理特性所决定，种皮（或果皮）中不透水的栅栏细胞层具有机械阻碍作用，使种子无法与外界环境交换气体、水分，从而无法萌发。破除种皮的机械阻碍作用后，种子萌发阻力不可逆地消失，物理休眠随之解除，并且不会再产生新的机械阻碍^{［32，36］}。物理休眠种子的萌发受限于外部结构性屏障的限制，种胚本身非休眠，且缺乏通过激素平衡调控的生理休眠机制，因此，即使热休眠诱导后，解除休眠的种子可能也不会进入热休眠状态^［37］。生理休眠类型种子由于种胚的生理抑制作用阻碍种子萌发^［38］，部分会进入热休眠，这一过程通常是由于高温诱导下种胚的代谢反应引发ABA积累或ABA与GA的失衡，从而抑制萌发，使种子进入热休眠状态^［39］。研究^［40］发现，在高温诱导下，拟南芥种子通过调节相关基因表达促进ABA积累并抑制GA合成，从而进入热休眠状态。秋子梨种子进入热休眠是由于高温诱导过程中种子对ABA敏感性增强，种子内源激素ABA含量升高，GA含量下降所导致^［41］。

综上所述，不同初生休眠类型种子在适宜萌发温度和热休眠诱导响应上存在一定差异。物理休眠种子适宜萌发温度范围较宽，种子间的最适温度较为一致。非休眠和生理休眠种子适宜萌发温度范围较窄，种子间最适萌发温度具有一定差异。非休眠和物理休眠种子在高温下萌发未进入热休眠，生理休眠种子在高温下是否进入热休眠状态表现不一致。在生产实践中，应根据种子休眠类型和树种种类选择适宜的温度，以提高种子的发芽率和幼苗成活率。

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基金资助

国家自然科学基金项目(31670639)