叶面TiO₂-NPs预处理对UV-B胁迫下小麦幼苗生长抑制的缓解效应

Alleviative Effects of Foliar TiO₂-NPs Pretreatment on Wheat Seedling Growth under UV-B Stress

摘要

为了揭示叶面TiO₂-NPs（二氧化钛纳米颗粒）预处理对UV-B胁迫下小麦幼苗生长抑制的缓解效应，以小麦（Triticum aestivum）为研究材料，在细胞水平、生理生化水平和基因水平综合研究UV-B胁迫和叶面TiO₂-NPs预处理下小麦幼苗有丝分裂、DNA损伤、抗氧化酶系统和抗氧化相关基因表达特征。结果表明：叶面10 mg∙L^-1 TiO₂-NPs预处理可以显著缓解低剂量（5.04 kJ∙m^-2）和高剂量（10.08 kJ∙m^-2）UV-B胁迫对小麦幼苗生长的抑制作用。低剂量和高剂量UV-B胁迫下，叶面TiO₂-NPs预处理小麦幼苗的株高比对照分别增加44.71%和127.43%，根长分别增加38.92%和159.10%，植株鲜质量分别增加50.03%和78.67%，干质量分别增加37.33%和126.84%。在低剂量和高剂量UV-B胁迫下，叶面TiO₂-NPs预处理的小麦根尖细胞有丝分裂异常比例仅为对照的39.57%和28.63%，细胞内部嘧啶二聚体（CPDs）含量也较对照组分别降低了60.43%和48.81%。抗氧化系统相关试验结果显示，在低剂量和高剂量UV-B胁迫下，叶面TiO₂-NPs预处理小麦叶片黄酮醇含量分别是对照的1.44倍和1.53倍，黄酮醇合成基因（CHS和CHI）和超氧化物歧化酶基因SOD的表达显著上调，提高了植物活性氧（ROS）清除能力。综上，叶面10 mg∙L^-1 TiO₂-NPs预处理可以显著增强小麦幼苗抗氧化系统活性，减少ROS对植物的损伤效应，提高植物对UV-B胁迫的耐受性。

Abstract

The aim of this study was to reveal the alleviating effect of foliar pretreatment with TiO₂-NPs （titanium dioxide nanoparticles） on the growth of wheat seedlings under UV-B stress. Using T.aestivum as material， the effects of leaf TiO₂-NPs pretreatment on mitosis， DNA damage， antioxidant enzyme system， and antioxidant-related genes in the alleviation of UV-B stress were comprehensively studied at the cellular， physiological， biochemical， and genetic levels. The results showed that 10 mg⋅L^-1 TiO₂-NPs foliar pretreatment significantly alleviated the inhibition of wheat seedling growth under low-（5.04 kJ⋅m^-2） and high-dose（10.08 kJ⋅m^-2） UV-B stress conditions. After UV-B stress， plant height of TiO₂-NPs-treated wheat seedlings increased by 44.71% and 127.43%， root length increased by 38.92% and 159.10%， fresh weight increased by 50.03% and 78.67%， and dry weight increased by 37.33% and 126.84%， respectively. The proportion of mitotic abnormalities in root tip cells of TiO₂-NPs pre-treated wheat seedlings was only 39.57% and 28.63% under low and high doses of UV-B stress， respectively， and the CPDs content in cells decreased by 60.43% and 48.81%， respectively， compared with the control group. TiO₂-NPs foliar pretreatment increased the flavonol content by 1.44 times and 1.53 times under low- and high-dose UV-B stress， respectively， significantly increased the expression of flavonol synthesis genes（CHS and CHI） and SOD， and improved the ROS scavenging ability of wheat seedlings. In conclusion， foliar pretreatment with 10 mg⋅L^-1 TiO₂-NPs significantly improved the activity of plant antioxidant system， reduced the ROS-caused damage on wheat plants， and improved the tolerance of plants to UV-B stress.

Graphical abstract

关键词

小麦 / UV-B胁迫 / 二氧化钛纳米颗粒 / 抗氧化酶活性 / 抗逆性

Key words

Triticum aestivum / UV-B stress / TiO₂-NPs / antioxidant enzyme activity / stress resistance

近些年，地球南北极上空的臭氧空洞仍在持续增大，地球表面受到的UV-B（280~320 nm）辐射逐渐增强，由此带来一系列生态环境问题，对高原地区农作物的生长构成严峻威胁^［1］。作为生态系统中最重要的生产者，植物因其生长模式、特性，对增强的UV-B辐射非常敏感。UV-B作为一种重要的光信号，参与植物的生长发育调控和胁迫响应^［2］，适量的UV-B可以调控植物光形态建成和次生代谢产物合成（如黄酮醇、花青素等）^［3-4］。然而，过量的UV-B辐射会诱导胁迫响应，如DNA损伤、嘧啶二聚体（CPDs）积累及活性氧（ROS）爆发等，从而导致植物有丝分裂异常、植株矮化、叶片萎蔫甚至死亡^［5-7］。因此，提高植物在UV-B胁迫下的适应能力，对增强植物应对未来生态环境变化的能力尤为重要。

大量研究表明，纳米材料的规模化应用为现代农业发展带来了新的机遇。目前，应用比较广泛的纳米材料主要有纳米银颗粒（Ag-NPs）、二氧化钛纳米颗粒（TiO₂-NPs）、氧化锌纳米颗粒（ZnO-NPs）、二氧化铈纳米颗粒（CeO₂-NPs）和碳量子点等^［8-9］，这些纳米材料可作为纳米化肥、纳米农药和生物传感器^［10-11］。相较于传统产品，纳米农药和纳米化肥由于尺度上的特性，具有更高的作用效率，目前，一些纳米产品已经可以替代传统低效的农业化学产品^［12-13］。在这些已被应用的纳米材料中，TiO₂-NPs因其独特的光催化特性和紫外屏蔽能力，在生物抗逆领域展现出一定的潜力，尤其在农业领域，TiO₂-NPs肥料可以提高植物对土壤中微量营养元素的生物利用率，显著促进芥菜（Brassica juncea）根茎生长，含有TiO₂-NPs的污泥可以促进番茄（Solanum lycopersicum）生长^［14-16］。值得注意的是，基于TiO₂-NPs的物理特性，其对UV-B辐射的反射率高达90%以上，例如TiO₂-NPs可以显著降低UV-B胁迫下大型蚤（Daphnia magna）的死亡率，这一特性使其有望成为潜在的“防晒剂”^［17］。然而，纳米材料的生物学效应具有显著的“浓度-尺寸-物种”依赖性，如不同浓度TiO₂-NPs对欧芹（Petroselinum crispum）种子萌发的促进作用存在明显差异^［18］，不同浓度TiO₂-NPs会促进或抑制蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）的光合作用^［19］。因此，TiO₂-NPs能否作为“植物防晒剂”协同调控植物UV-B胁迫响应，其分子机制和潜在生态风险仍亟待解析。

小麦（Triticum aestivum）是我国北方的主要粮食作物，在高原地区更容易受到UV-B胁迫的影响。目前，对植物响应UV-B胁迫的研究主要以光信号响应机制和胁迫响应机制为主，对纳米材料与UV-B胁迫的复合效应鲜有报道。深入研究TiO₂-NPs对UV-B胁迫抑制植物生长的缓解作用，对于提高作物产量、促进农业可持续发展具有一定价值^［20］。因此，为了确定TiO₂-NPs在植物响应UV-B胁迫中发挥的作用，本研究通过整合生理生化指标、DNA损伤指数、细胞有丝分裂指数和基因水平等，系统解析叶面TiO₂-NPs预处理对UV-B胁迫下植物抗氧化防御系统的影响，为阐明叶面TiO₂-NPs预处理对植物UV-B胁迫的缓解机制提供理论支撑。

1 材料和方法

1.1　纳米材料特性

锐钛矿型TiO₂-NPs购自北京德科岛金科技有限公司（http：//www.dknano.com）。TiO₂-NPs的粒径在5 nm左右，纯度99%，与TiO₂相比分散性能更好，并且具有非常好的水溶性。分别配制了0.1、1.0、10.0、100.0 mg∙L^-1的TiO₂-NPs胶体溶液，利用紫外可见分光光度计（UH5300，HITACHI，日本）测量不同质量浓度TiO₂-NPs胶体溶液的紫外吸光度及紫外透光率。由测量结果可以看出：10 mg∙L^-1 TiO₂-NPs胶体溶液基本上可以阻隔大部分的UV-B辐射（280~320 nm）；100 mg∙L^-1 TiO₂-NPs隔离UV-B的效果最好，但是由于质量浓度太高，静置后容易出现沉淀，并且高质量浓度的TiO₂-NPs有可能对植物产生生物毒性^［21］，因此，选择10 mg∙L^-1 TiO₂-NPs作为本研究的处理质量浓度。

1.2　植物材料培养与处理

试验植物材料为小麦品种‘晋麦-79’，种子购自山西农业大学小麦研究所。小麦种子用1.5%次氯酸钠灭菌处理10 min，灭菌水冲洗10 min，转移至25 ℃、相对湿度60%的黑暗培养箱中萌发1 d。待种子萌发后选择长势一致的小麦转移至培养皿中，每皿70粒，每个处理3组重复。在光16 h/暗8 h、22 ℃（光）/18 ℃（暗）、相对湿度50%环境下培养。

UV-B胁迫处理参考之前实验室的研究结果，UV-B胁迫的剂量为10.08 kJ∙m^-2（高剂量处理）和5.04 kJ∙m^-2（低剂量处理）^［22］。UV-B胁迫的剂量借助紫外辐射照度仪测量。从小麦露白开始采用叶面TiO₂-NPs预处理和不同剂量的UV-B胁迫处理小麦幼苗，连续处理5 d。TiO₂-NPs处理质量浓度为10 mg∙L^-1，处理组设置空白对照组（C）、TiO₂-NPs处理组（T）、低剂量UV-B处理组（L）、高剂量UV-B处理组（H）、TiO₂-NPs预处理及低剂量UV-B处理组（LT）和TiO₂-NPs预处理及高剂量UV-B处理组（HT）共6个处理组。每天在UV-B胁迫处理前均匀地将TiO₂-NPs喷洒于植物表面，喷洒3次，连续处理5 d，处理结束后取样测定相关指标。

1.3　指标及测定方法

1.3.1　叶片生理生化指标测定

从小麦露白开始采用叶面TiO₂-NPs预处理和不同剂量的UV-B胁迫处理小麦幼苗，连续处理5 d，根据相关生理指标检测要求，对每个处理组的小麦叶片分别取样检测，每个处理组至少做3个重复。参考韩榕等^［6-7］的方法测定总黄酮、超氧阴离子（{\mathrm{O}}_{\mathrm{2}}^{·-}）、过氧化氢（H₂O₂）、丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）活性：采用氯化铝比色法测定总黄酮含量；使用超氧阴离子含量检测试剂盒（索莱宝，中国）测定{\mathrm{O}}_{\mathrm{2}}^{·-}含量；使用过氧化氢含量检测试剂盒（索莱宝，中国）测定H₂O₂含量；采用硫代巴比妥酸（TBA）显色法测定MDA含量；采用氮蓝四唑（NBT）还原法测定SOD活性；根据愈创木酚在470 nm波长吸光度的变化检测POD活性；采用过氧化氢还原法检测CAT活性。

使用便携式叶绿素荧光仪（PAM-2100，WALZ，德国）测定光系统Ⅱ（PSⅡ）最大光化学效率（F_v/F_m）。每个处理至少选取15片叶片，待测叶片在测量前进行暗处理5~10 min，在“F_m”键打开饱和脉冲时，强度和持续时间预设为10.0 s和0.8 s，根据仪器报告文件获得不同处理组植物叶片的最大荧光产量（F_m）和最小荧光产量（F_o），并据此计算PSⅡ最大光化学效率（F_v/F_m=（F_m-F_o）/F_m），对 PSⅡ的检测每个处理组至少3次重复。

用ELISA试剂盒检测叶片细胞中嘧啶二聚体（CPDs）含量。在UV-B胁迫处理后，立即使用EasyPure^® Plant Genomic DNA Kit（全式金，中国）提取植物基因组DNA，按照OxiSelect™ UV-Induced DNA Damage ELISA Kit（Cell Biolabs，美国）的要求分别加入嘧啶二聚体抗体和辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗，通过酶标仪（SynergyLX，Bio Tek，美国）检测450 nm处的吸光度，利用试剂盒中标准样品确定标准曲线，通过回归曲线方程Y=0.001 62X+0.163（R²=0.965，Y表示450 nm处的吸光度，X为样品中CPDs含量）计算各处理组CPDs含量。

1.3.2　单细胞凝胶电泳

采用单细胞凝胶电泳进行彗星试验，检测DNA损伤。UV-B处理小麦幼苗5 d，将每个处理组的小麦叶片（0.1 g）切割成1 mm左右，加入酶液（1.5%纤维素酶、0.3%果胶酶、0.5 mol∙L^-1甘露醇、0.5 mmol∙L^-1 KH₂PO₄、2 mmol∙L^-1 MgSO₄、3 mmol∙L^-1 MES和5 mmol∙L^-1 CaCl₂，pH=5.8），28 ℃黑暗培养箱中培养4 h，75 µm滤网过滤酶液，4 ℃下500 r·min^-1离心10 min。弃去上清液，沉淀用2 mL预冷的PBS（pH=7.4）重悬，再次离心并重复3次。离心后的悬液与低熔点琼脂糖（体积比为1∶3）混合均匀，制成载玻片-琼脂糖-细胞悬液的三明治模型，浸入预冷的裂解液（2 mol·L^-1 NaCl、100 mmol·L^-1 EDTA-Na₂和10 mmol∙L^-1 Tris，pH=10.0）4 ℃避光裂解30 min，在碱性缓冲液（300 mmol∙L^-1 NaOH和1 mmol∙L^-1 EDTA，pH>13）25 V、120 mA电泳20 min。电泳结束后用Tris-HCl（pH=7.5）中和碱性缓冲液，200 μL 10 μg∙mL^-1溴化乙锭避光染色10 min。使用荧光显微镜（奥林巴斯BX53，日本）采集各处理组的照片，使用CASP软件分析彗星图像^［23］。

1.3.3　化学染色分析

通过卡宝品红染色观察小麦根尖有丝分裂。取不同处理小麦根尖放入2 mL EP管，双蒸水清洗后加入2 mL卡诺氏固定液固定2 h，双蒸水清洗后加入1 mol∙L^-1 HCl 60 ℃解离10 min，清洗后的样本置于载玻片上，滴加卡宝品红染色10 min。使用荧光显微镜（奥林巴斯BX53，日本）采集各处理组的照片。

使用二苯硼酸-2-氨基乙酯（DPBA）荧光染料对处理前后植物叶片中的黄酮醇进行原位分析。小麦萌发后生长5 d，TiO₂-NPs和10.08 kJ∙m^-2 UV-B处理1 d，立刻取每个处理组的叶片浸入DPBA染液（0.25%DPBA、0.01%Triton X-100和95%乙醇）中染色1.5 h。采用荧光显微镜（奥林巴斯BX53，日本）采集图片，458 nm波长激发DPBA荧光。使用ImageJ软件对图片进行荧光定量分析。

1.3.4　SOD同工酶PAGE电泳

采用PAGE电泳分析TiO₂-NPs和UV-B胁迫对SOD同工酶的影响。萌发后生长5 d的小麦在TiO₂-NPs和5.04 kJ∙m^-2 UV-B处理1 d后立刻称取0.15 g叶片组织，加入2 mL提取缓冲液（50 mmol∙L^-1 PBS（pH=7.0），1 mmol∙L^-1 EDTA-Na₂，1%PVPP），冰上充分研磨，12 000 g，4 ℃离心20 min，吸取上清液，酶液与上样缓冲液混合（体积比为1∶1）进行PAGE电泳（冰浴）。电泳结束后双蒸水冲洗，黑暗环境2.45 mmol∙L^-1的NBT反应20 min，置换为反应液2（36 mmol∙L^-1 PBS（pH=7.8），28 μmol∙L^-1核黄素，28 mmol∙L^-1 TEMED）黑暗反应15 min，最后加入反应液3（50 mmol·L^-1 PBS（pH=7.8）， 10 mmol·L^-1 TEMED）光照处理出现清晰的SOD同工酶条带。双蒸水洗去多余反应液，利用平板凝胶成像扫描仪（WD-9413B，中国）采集图片，利用Photoshop5软件处理图像。

1.3.5　黄酮醇合成相关基因和抗氧化酶基因的RT-qPCR分析

按照EasyPure^® Universal Plant Total RNA Kit（全式金，中国）说明书的方法提取各处理组小麦幼苗RNA，参照EasyScript^® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（全式金，中国）方法合成cDNA第1条链，RT-qPCR使用PerfectStart^® Green qPCR SuperMix（全式金，中国），反应条件为94 ℃，5 s；60 ℃，15 s，共40个循环，RT-qPCR引物序列见表1，内参基因为ACTIN。采用2^-ΔΔCt方法计算基因的相对表达量。

1.4　数据处理

本研究所有的数据分析结果均采用至少3个独立重复的平均值±标准差（SD）的方法表示，数据分析使用SPSS 17.0软件。分析方法为单因素方差分析（one-way ANOVA），结果进行Tukey’s test检验，P<0.05表示试验结果具有统计学意义，使用Graphpad Prism 5软件制图。

2 结果与分析

2.1　 TiO₂-NPs预处理和UV-B胁迫对小麦幼苗生长的影响

低剂量（5.04 kJ∙m^-2）和高剂量（10.08 kJ∙m^-2）UV-B胁迫5 d时各处理组露白的小麦表型观察结果如图1A所示，在H组和HT组小麦叶片和根部出现严重损伤的表型（图1A），小麦叶片生长受到明显抑制，叶片形态也出现严重弯曲，小麦根生长也受到明显抑制。L组叶片和根的生长表现出明显抑制，相比之下，叶面TiO₂-NPs预处理的LT组小麦生长未见明显抑制。以上结果表明，叶面TiO₂-NPs预处理可以有效保护植物免受UV-B胁迫损伤。

在低剂量和高剂量UV-B胁迫下，叶面TiO₂-NPs预处理的小麦株高、根长、鲜质量和干质量差异显著。小麦的株高LT组较L组高44.71%，HT组较H组高127.43%（图1B）；根长LT组较L组高38.92%，HT组较H组高159.10%（图1C）；鲜质量LT组较L组高50.03%，HT组较H组高78.67%（图1D）；干质量LT组较L组高37.33%，HT组较H组高126.84%（图1E）。对照组（C）和TiO₂-NPs预处理组（T）的PSⅡ光能转化效率分别为0.79和0.77，说明叶面TiO₂-NPs预处理不会影响植物正常的光合作用。低剂量UV-B胁迫下，LT组植株叶片F_v/F_m为0.62，L组植株叶片F_v/F_m为0.45；高剂量UV-B胁迫下，H组和HT组植株叶片光合作用都受到明显抑制（图1F）。以上结果表明，叶面TiO₂-NPs预处理可以显著缓解UV-B胁迫对小麦生长的抑制作用。

2.2　 TiO₂-NPs预处理和UV-B胁迫对小麦根尖细胞有丝分裂的影响

UV-B胁迫导致小麦根尖分生区细胞有丝分裂异常，有丝分裂中期出现游离染色体，有丝分裂后期可见大量染色体因不能正确分离形成的染色体桥（图2）。相比之下，TiO₂-NPs预处理显著缓解了小麦根尖分生区细胞有丝分裂异常的发生，偶见有丝分裂后期出现个别染色体桥的现象。通过对有丝分裂异常的统计（表2）可知，UV-B胁迫导致小麦根尖处于有丝分裂期的细胞中13.42%（L组）和34.37%（H组）的分裂期细胞出现异常分裂现象（如游离染色体、染色体桥和落后染色体），而TiO₂-NPs预处理可以显著降低异常分裂发生的比例，异常比例为5.31%（LT组）和9.84%（HT组）。以上结果说明，TiO₂-NPs预处理可以更有效地缓解UV-B胁迫对小麦根尖细胞有丝分裂的影响。

2.3　 TiO₂-NPs预处理和UV-B胁迫对小麦叶片细胞DNA损伤的影响

不同处理下小麦叶片细胞DNA损伤的彗星图像如图3A所示，红色内部为细胞核DNA聚集区域，紫色区域为DNA链断裂后形成的彗星尾部。T组和C组细胞核DNA聚集形成一个致密的圆形，彗星头部较大，几乎没有DNA迁移至彗星的尾部区域。UV-B胁迫后，LT组、L组、HT组和H组的DNA发生断裂脱离细胞核向后迁移，形成了彗星的尾部（图3A）。通过CASP软件得到单细胞凝胶电泳后的橄榄尾距（olive tail moment，OTM），OTM大小反映细胞内部DNA损伤程度，高剂量UV-B胁迫后H组的OTM约为43.87，相比之下，TiO₂-NPs处理组（HT组）的OTM仅为14.12；低剂量UV-B胁迫下，TiO₂-NPs处理（LT组）的OTM显著低于L组（图3B）。上述结果说明，叶面TiO₂-NPs预处理能够在UV-B胁迫下保护小麦叶片细胞DNA免受损伤，进而减少UV-B胁迫对小麦幼苗的伤害。

如图3C所示，UV-B胁迫造成细胞内CPDs产生，TiO₂-NPs预处理可以显著降低CPDs含量，低剂量UV-B胁迫下LT组CPDs含量较L组低60.43%，高剂量UV-B胁迫下HT组CPDs含量较H组低48.81%。

2.4　 TiO₂-NPs预处理和UV-B胁迫对小麦抗逆生理生化指标的影响

2.4.1　对小麦叶片黄酮醇含量的影响

通过检测不同处理组DPBA荧光信号强度发现（图4A），叶面喷施TiO₂-NPs显著促进叶片黄酮醇的合成，T组叶片总黄酮含量约为C组的3.42倍；UV-B胁迫下，叶片总黄酮含量显著上调，低剂量UV-B胁迫时LT组约为L组的1.44倍，高剂量UV-B胁迫时HT组约为H组的1.53倍（图4B）。叶片总黄酮含量的变化趋势与DPBA染色的结果一致，TiO₂-NPs预处理（T组、LT组和HT组）的叶片总黄酮含量显著高于对照组（C组、L组和H组）（P<0.05）。RT-qPCR检测了与黄酮醇合成相关基因（CHS和CHI）的表达情况，结果显示，TiO₂-NPs预处理可以显著提高小麦叶片CHS和CHI基因的表达。以上结果说明，TiO₂-NPs预处理能够上调叶片中黄酮醇合成，进而增强植物ROS清除能力，保护植物免受UV-B胁迫的伤害。

2.4.2　对小麦叶片超氧阴离子和过氧化氢含量的影响

叶面喷施TiO₂-NPs可以显著降低叶片{\mathrm{O}}_{\mathrm{2}}^{·-}和H₂O₂含量（图5）。在未受UV-B胁迫的TiO₂-NPs处理组（T组）发现有少量{\mathrm{O}}_{\mathrm{2}}^{·-}生成，这可能与TiO₂-NPs的纳米特性有关。在正常光照条件下，TiO₂-NPs可能在植物叶片诱导产生一定的超氧阴离子，进而诱导植物黄酮醇合成相关基因表达，通过TiO₂-NPs预处理可以提前激活植物本身的抗氧化系统，促进植物在UV-B胁迫下的ROS清除能力。

2.4.3　对丙二醛含量和抗氧化酶活性的影响

如图6A所示，UV-B胁迫下，L组、H组叶片MDA含量显著升高，表明UV-B胁迫对植物细胞膜脂质产生严重损伤，与L组和H组相比，TiO₂-NPs预处理显著降低植物细胞膜脂质过氧化程度，LT组MDA含量仅为L组的43.26%，HT组MDA含量仅为H组的63.14%；未受UV-B胁迫下，C组和T组植物细胞MDA含量无显著差异。

UV-B胁迫后，低剂量UV-B胁迫下叶片SOD活性显著升高，其中，LT组SOD活性显著高于L组；在高剂量UV-B胁迫下，H组的SOD活性受到显著抑制，HT组的SOD活性与L组相近，高剂量UV-B胁迫下，TiO₂-NPs处理可以保持小麦叶片SOD活性（图6B）。与对照相比，UV-B胁迫显著提高叶片POD活性，TiO₂-NPs预处理提高低剂量UV-B胁迫叶片POD活性（图6C）。低剂量UV-B胁迫可以提高叶片CAT活性，高剂量UV-B胁迫显著降低H组叶片CAT活性，HT组的CAT活性在UV-B胁迫前后并未发生明显改变（图6D）。RT-qPCR检测结果表明，TiO₂-NPs预处理在UV-B胁迫前后都显著提高了SOD表达量，并且显著高于对照组（C组、L组和T组）；在UV-B胁迫前POD表达量与对照（C组）无明显差异，但在UV-B胁迫后其表达量显著高于L组和H组。

在单独TiO₂-NPs处理时，植物中Mn-SOD活性显著升高，UV-B胁迫后TiO₂-NPs处理组中Mn-SOD、Fe-SOD和Cu/Zn-SOD活性都显著上调（图6E），说明TiO₂-NPs预处理后植物叶片中SOD活性显著上调。

3 讨论

3.1　 TiO₂-NPs预处理有效缓解UV-B胁迫对小麦幼苗生长的抑制作用

UV-B胁迫对植物幼苗的生长具有较强的抑制作用，本研究通过叶面喷施TiO₂-NPs有效缓解UV-B辐射对小麦幼苗的胁迫，小麦叶片的形态及各项生理指标显著优于单独UV-B辐射处理组，这与Sun等^［24］在氧化铈纳米颗粒对植物UV-B胁迫的缓解作用结果相似，表明TiO₂-NPs作为一种重要的纳米材料在农业上有潜在的应用价值。目前，TiO₂-NPs作为纳米农药的辅助材料对植物的生理和分子效应已经被试验证实^［25］，如在植物抗逆研究中发现TiO₂-NPs可以提高大豆（Glycine max）对镉胁迫的耐受性^［26］，提高蚕豆（Vicia faba）的耐盐性^［27］等。本研究揭示了叶面喷施TiO₂-NPs对小麦幼苗UV-B胁迫的缓解效应，TiO₂-NPs缓解UV-B胁迫对植物PSⅡ的光抑制，有效屏蔽了UV-B辐射，为植物抵御UV-B胁迫构筑了第一道物理防线；UV-B胁迫下，叶面TiO₂-NPs预处理的小麦幼苗株高、根长、鲜质量和干质量显著高于对照，有效缓解了UV-B胁迫对植物生长的抑制作用，这与Sun等^［28］的研究结果一致。同时，本研究结果表明，TiO₂-NPs作为纳米农药辅助材料，应用效果存在“浓度-物种”依赖性，10 mg∙L^-1的TiO₂-NPs胶体溶液避免了在水相中的团聚和光遮蔽效应，确保可见光的透过率，维持植物正常的光合效率，这一结果不同于之前TiO₂-NPs对蛋白核小球藻光合作用的抑制作用^［19］。以上结果表明，叶面TiO₂-NPs预处理可能通过增强小麦幼苗的“防晒”作用缓解UV-B胁迫的损伤，但防护能力存在一定的浓度依赖性。

3.2　 TiO₂-NPs预处理缓解UV-B胁迫对小麦根尖有丝分裂的影响

UV-B胁迫可以导致植物细胞有丝分裂异常，如落后染色体、染色体桥和多束分裂等，这主要源于UV-B胁迫诱导产生的嘧啶二聚体和细胞内活性氧的累积，导致DNA发生损伤并无法正常修复，进而引起异常有丝分裂的发生^［6-7］。本研究发现，TiO₂-NPs预处理可以有效减少小麦根尖细胞中DNA的损伤和嘧啶二聚体的累积，可以有效降低小麦根尖有丝分裂异常的比例，这与韩榕等^［6］的研究结果相一致。本研究中，TiO₂-NPs预处理使DNA损伤显著减少，并显著降低了有丝分裂畸变的比例，这一结果可能归因于TiO₂-NPs物理屏蔽减少DNA直接损伤，这与之前研究的纳米二氧化硅、纳米二氧化铈等在逆境胁迫中发挥的缓解效应存在一定差异，二氧化铈等纳米材料主要以纳米酶的方式缓解植物逆境胁迫^［29-30］，TiO₂-NPs在激活植物抗氧化系统的同时，通过物理屏蔽进一步提高了小麦幼苗对UV-B胁迫的适应性。

3.3　 TiO₂-NPs预处理激活UV-B胁迫下小麦的抗氧化系统

UV-B胁迫主要通过产生大量ROS损伤植物，植物抗氧化系统的激活有利于清除胁迫产生的ROS^［31］。本研究中，叶片TiO₂-NPs预处理通过提高抗氧化酶活性和促进黄酮醇合成，为植物抵御UV-B胁迫构建第二道防线。UV-B胁迫导致植物叶片中ROS爆发，引起细胞膜脂质过氧化和DNA损伤，低剂量UV-B胁迫下TiO₂-NPs预处理显著上调了SOD、POD和CAT活性，但是在高剂量UV-B胁迫下，仅有SOD活性被显著增强，TiO₂-NPs对植物的保护与SOD活性的改变存在更为显著的关联，本研究通过非变性电泳证实TiO₂-NPs调控SOD同工酶的时空表达。结合先前的研究成果^［28］，Mn-SOD活性的增强可能通过保护线粒体电子传递链减少ROS泄漏，而Cu/Zn-SOD的激活可以清除胞质和叶绿体中的超氧阴离子，TiO₂-NPs预处理帮助植物增强了抗氧化能力。此外，UV-B胁迫显著上调黄酮醇合成相关基因的表达量，TiO₂-NPs预处理的小麦叶片中黄酮醇含量显著高于对照，黄酮醇作为UV-B吸收和ROS清除的重要物质，进一步减少了ROS对植物DNA和膜系统损伤。值得注意的是，TiO₂-NPs在非UV-B胁迫下轻微诱导超氧阴离子的生成，同时，可以检测到Mn-SOD的活性显著上调，说明TiO₂-NPs通过ROS信号通路激活植物的抗氧化防御系统，使植物在UV-B胁迫下可以更快响应，这一研究结果与Moradi等^［32］在TiO₂-NPs处理藏红花（Crocus sativus）中的发现相一致。本研究结果表明，通过预处理TiO₂-NPs可为植物构建“物理-生化”的双重防线，增强植物对UV-B胁迫的耐受性，为纳米材料的农业应用提供新的思路。

4 结论

叶面喷施TiO₂-NPs通过物理防护与生理代谢调控的协同作用，有效减少了UV-B胁迫对小麦幼苗的损伤，通过物理防护减少UV-B胁迫对小麦叶片细胞DNA和细胞膜脂质的损伤，同时叶面喷施TiO₂-NPs上调黄酮醇合成相关基因和SOD基因的表达，激活了小麦叶片的抗氧化酶系统，提高了植物ROS清除能力，进一步增强了TiO₂-NPs对小麦幼苗UV-B胁迫的缓解效应。

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基金资助

山西省基础研究计划项目(20220321212385)

山西电子科技学院人才引进科研启动基金项目(2023RKJ025)

植物大分子逆境响应山西省重点实验室基金项目(DFZ2024002)