香果树种子萌发的光照需求及其转录组响应分析

Light Requirements for Germination of Emmenopterys henryi Oliv. Seeds and Transcriptome Response Analysis

摘要

为探究中国特有濒危植物香果树（Emmenopterys henryi）种子萌发所需光照时间及不同光照时间下种子形态性状与萌发率间相关性，以香果树种子为研究材料，比较0、1、2（8 h/1st day+4 h/2nd day）、2、4、6、8 d光照处理下种子萌发率差异，观察并分析种子形态与萌发时间相关性。同时，利用高通量测序技术对经避光（2 d）与基础光照（种子萌发率≥50%所需的最短光照时间，2 d）处理的香果树种子进行转录组测序与分析。结果显示：光照处理条件下，供试种子萌发率随光照时间延长而提高，8 d光照处理种子培养至10 d萌发率为98.89%；种子形态特征与萌发时间相关性分析结果显示，种仁长、种仁长宽比与萌发时间呈显著负相关（P<0.05）。避光（2 d）与基础光照（2 d）处理的种子转录组响应及其生物信息学解析共发现4 657个显著差异表达基因（DEGs），上调表达的基因为2 950个，下调表达的基因为1 707个。鉴定出的185个转录因子中，光照处理组HSF家族成员全部表达下调，蛋白质代谢相关GO term被显著富集。DEGs在二萜生物合成（ko00904）、半胱氨酸与甲硫氨酸代谢（ko00270）和植物-病原菌互作（ko04626）等与胚发育、种苗抗逆性相关的KEGG通路上显著富集（P-adjust<0.05）。综上，香果树种子中种仁较大者萌发更早，光照2 d可满足香果树种子萌发的基本需求。该研究为揭示香果树野外种群结构异常的形成机制及推动野外种群复壮提供理论依据。

Abstract

This study aimed to investigate the light duration required for seed germination of Emmenopterys henryi Oliv.， an endangered species endemic to China， and to explore the correlation between morphological traits and germination rate of seeds under different light durations. Using E. henryi seeds as material， this study compared the differences in germination rates under light treatments of 0， 1， 2（8 h/1st day+4 h/2nd day）， 2， 4， 6， 8 d. The correlation between seed morphology and germination time was also analyzed. In addition， transcriptome sequencing and analysis using high-throughput technology were perfomed on E. henryi seeds subjected to dark treatment （2 d） and basic light exposure （the shortest light duration required for a germination rate of ≥50%， 2 d）. Results showed that， under light treatment conditions， the germination rates increased with extension of light duration. For the seeds subjected to the 8 d light treatment， the germination rate reached 98.89% after 10 d of cultivation. The analysis of correlation between seed morphological characteristics and germination time showed that the length of seed kernel and length-to-width ratio of seed kernel were significantly negatively correlated with germination time（P<0.05）. Transcriptomic responses of the seeds following dark treatment（2 d） and basic light treatments（2 d） indicated 4 657 differentially expressed genes（DEGs）， including 2 950 upregulated and 1 707 downregulated genes. Among the 185 transcription factors identified， all members of the HSF family were downregulated in the light treatment group. GO terms related to protein metabolism were significantly enriched. DEGs were significantly enriched in KEGG pathways（P-adjust<0.05） related to embryo development and seedling stress resistance， including diterpenoid biosynthesis （ko00904）， cysteine and methionine metabolism（ko00270）， and plant-pathogen interaction（ko04626）. In summary， E. henryi seeds with larger kernels germinated earlier， and light supplied for two days was sufficient to meet the basic germination requirements of the seeds. This study provided a theoretical basis for elucidating the mechanisms underlying the abnormal population structure of wild E. henryi populations and for promoting its population restoration in natural conditions.

Graphical abstract

关键词

香果树 / 种子 / 光照 / 萌发 / 转录组

Key words

Emmenopterys henryi / seed / light / germination / transcriptome

香果树（Emmenopterys henryi）隶属茜草科（Rubiaceae）香果树属（Emmenopterys），第三纪冰川幸存孑遗植物之一，国家二级重点保护植物^［1-2］。由于种群数量稀少、天然更新能力较弱^［3］，亟需深入研究其生态适应机制以促进种群保护与恢复。已有研究多集中在香果树的自然分布、种群结构调查^［4-5］、种苗繁育技术^［6-7］及逆境胁迫生理响应机制^［8-9］等方面，对于种子萌发过程中的光照需求及相关生理机制研究仍显不足。

香果树于丰产年产种量较大^［10］，但野生种群分布格局往往呈现集群状^［11］，且径级和苗龄结构普遍呈橄榄型，幼苗数量稀少，种群呈逐步衰退趋势^［3］。部分学者认为，这一现象可能与种子多数未掉落至土壤表面^［12］、光照不足^［6］或林下枯落物对种子产生化感效应^［7］等原因导致的种子萌发受限有关。在众多影响因素中，光照被认为是影响香果树种子萌发的主要调节因素^［13］。研究^［6］表明，香果树种子具有明显的光敏感性，属于光照积累萌发型种子，只有在光照条件下才能有效萌发，且随着光照时间增加、光照强度和温度提高，种子萌发率整体呈上升趋势^［14］。林下枯落物可阻挡阳光，抑制香果树种子胚根与土壤的接触，从而阻碍香果树种子的萌发^［10］。

近年来，香果树种子野外萌发受限的相关研究^［6-7］已取得了一定进展，但对于种子萌发所需的基础光照时间（即萌发率≥50%所需的最短光照时间）及种子自身形态性状是否会影响萌发，目前尚无明确结论。转录组测序技术（RNA sequencing，RNA-seq）可用于揭示植物不同发育时期的基因表达差异和应对生境变化的响应机制^［15］，可作为评估种子是否解除休眠状态的主要手段之一^［16-17］。因此，本研究以采集自武夷山桐木关的香果树种子为对象，结合形态学和转录组学方法，探究香果树种子萌发所需光照条件及其在不同光照时间下形态性状与萌发率之间的相关性，并对比分析在暗环境与基础光照时间处理下香果树种子的转录组差异表达情况。本研究可为揭示香果树种群结构异常及野外实生苗稀少的原因提供理论依据，从而为维持和提升香果树的种群规模和数量，推动繁育与种植技术的发展提供科学支持。

1 材料与方法

1.1　研究材料

香果树种子，2020年11月采自武夷山桐木关。

1.2　研究方法

1.2.1　香果树种子对不同光照时间的萌发响应观察

以避光复水处理12 h有明显吸涨反应的香果树种子为研究对象，每30粒为1组，置于无菌培养皿中，分别进行避光（0 DY组）和光照1（1 DY组）、2（8 /1st day+4 h/2nd day（2 DY*组）、2（2 DY组）、4（4 DY组）、6（6 DY组）、8 d（8 DY组）处理（光照处理1 d为4 000 lx光照下培养12 h，暗培养12 h），培养温度为25 ℃，各处理重复3次，采用SPSS 21.0软件对各处理组香果树种子培养4~10 d的累计萌发率进行单因素方差分析（Oneway ANOVA），并采用LSD法进行多重比较。

1.2.2　香果树种子外形观察

随机选取1.2.1中2 DY组、4 DY组和6 DY组避光复水处理12 h种子（各组中种子不少于40粒），利用数码相机及Image J软件获取160粒种子外形性状数据，所测量的性状如下：种子面积（seed area，SA），种子含种翅的投影面积；种子长（seed length，SL），种子含种翅的长轴长度；种子宽（seed width，SW），种子含种翅的短轴长度；种子长宽比（seed length-to-width ratio，SL/SW）；种仁面积（seed kernel area，SKA），种子不含种翅的投影面积；种仁长（seed kernel length，SKL），种子不含种翅的长轴长度；种仁宽（seed kernel width，SKW），种子不含种翅的短轴长度；种仁长宽比（seed kernel length-to-width ratio，SKL/SKW）。

1.2.3　香果树种子外形与萌发时间相关性分析

随机选取1.2.2中2 DY组、4 DY组和6 DY组种子各40粒，观察记录上述种子分别进行2、4、6 d光照处理后，每粒种子萌发所需培养时间（萌发时间），利用SPSS 21.0分析不同光照处理下种子形态性状与萌发时间相关性。

1.2.4　香果树种子光照萌发转录组学研究

测序样品收集。取外形饱满未开裂果实，70%乙醇消毒30 s后，在无菌条件下收集种子，置于无菌培养皿中，加入适量无菌水。基于预试验结果，确定香果树种子萌发所需的基础光照时间（即萌发率≥50%所需的最短光照时间）为2 d，故对光照处理2 d的种子（G组）与避光处理2 d种子（A组）转录组数据进行比较，以探讨在此基础光照时间下，转录组差异表达影响种子萌发的机制，每组重复取样3次，用锡箔纸包裹，放入液氮快速冷冻处理后，置于超低温冰箱-80 ℃保存备用。

RNA提取与文库构建。利用全能型植物RNA提取试剂盒（康为世纪，中国）提取A组和G组种子总RNA。用超微量紫外可见分光光度计（Nano Drop 2000，美国）和琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。测序工作由上海美吉生物科技股份有限公司完成。利用带有Oligo（dT）的磁珠从总RNA中分离出带有Poly A尾结构的mRNA。利用Illumina Stranded mRNA Prep，Ligation试剂盒（Illumina，美国）构建cDNA文库。

转录组数据分析。利用基因测序仪（Novaseq 6000，美国）进行RNA测序和分析。测序数据已上传至中国科学院北京基因组研究所/国家生物信息中心国家基因组学数据中心（PRJCA042138）（https：//ngdc.cncb.ac.cn）^［18］。使用Trinity软件（https：//github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki）对clean reads进行de novo拼接和筛选，获得unigene。将unigene基因与NR数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/public/）进行BLAST比对；使用软件TransDecoder（http：//transdecoder.github.io/）对组装结果进行CDS预测；使用PlantTFDB（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）、KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/）和GO（http：//www.geneontology.org/）数据库，对差异表达的unigene进行功能注释。利用RSEM软件（http：//deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/）分析样品基因的表达量，以TPM为单位。差异表达基因（Differentially expressed genes，DEGs）用软件DESeq2（http：//bioconductor.org/packages/stats/bioc/DESeq2/）筛选，上调DEGs筛选标准为q-value<0.05，log₂FoldChange>1，下调DEGs筛选标准为q-value<0.05，log₂FoldChange<-1。

差异表达基因的qRT-PCR验证。从植物种子萌发过程中易显著富集的GO条目中^［19-22］，选择8个具有显著表达差异的基因，进行实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）分析。以GAPDH为内参基因，设计引物（表1），使用ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix试剂盒（诺唯赞，中国）对选定的目标差异基因进行定量分析，重复3次。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸30 s，40个循环。

2 结果与分析

2.1　香果树种子萌发对光照时间的响应

表2结果显示，0 DY组与1 DY组培养10 d种子几乎无萌发。其他光照处理组，除2 DY*组外，均有种子于培养4 d萌发，且培养至5~6 d，单日萌发种子数最高，但各组组内重复间萌发率在以上时间段存在一定差异，变异系数0~69.24%。培养6 d，2 DY*组和2 DY组萌发率分别仅有12.22%和38.89%，显著低于4 DY、6 DY和8 DY组。培养至7 d，各光照处理组种子萌发率存在显著差异，其中8 DY组萌发率最高，达95.56%。培养至8 d，4 DY、6 DY、8 DY组累计萌发率均超过80.00%。培养10 d，6 DY组与8 DY组萌发率较高，分别为90.00%和98.89%，2 DY*组萌发率仅为22.22%，显著低于其他光照处理组（除1 DY组外）。

2.2　香果树种子形态特征

香果树种子薄片状，具翅，长3.19~14.07 mm，宽1.62~4.02 mm，表面具网格状凸起（图1）。对160粒香果树种子形态性状进行统计分析（表3），结果显示，香果树种子面积平均为12.77 mm²，最小者仅3.30 mm²，较大者达24.29 mm²，变异系数为29.68%，这与香果树种子种翅长度变化较大有关。种仁相关性状中，种子个体间的种仁面积存在一定差异，变异系数为24.22%，其他种仁性状，如种仁长、种仁宽及种仁长宽比相对稳定，种仁长宽比变异系数仅为11.76%。

2.3　香果树种子形态与萌发时间相关性

不同光照时间下，种子形态性状与萌发时间相关性分析结果如表4。经2 DY光照处理，种子萌发所需培养时间与种仁长宽比呈显著负相关（r=-0.322），即具有狭长种仁的种子，萌发所需时间较短。4 DY组种子萌发时间与种仁长显著负相关（r=-0.394），即具有较长种仁的种子萌发时间较短。6 DY组种子萌发时间与种仁长及种仁长宽比呈显著负相关，即种仁长或狭长的种子萌发较早。3种光照时间处理下种子的萌发率与种子含翅外形性状无显著相关性。

2.4　测序数据质量分析

共获得原始数据（raw data）52.58 Gb，各样本raw data均达到7.12 Gb以上，去除低质量数据后，获得过滤后数据（clean data）42.92 Gb，各样本测序错误率（error rate）不超过0.026%，Q20和Q30分别达到97.65%和93.32%以上，所有样本GC含量为43.12%~43.82%。各样本测序原始数据总条目数（raw reads）均在47 134 170以上，质控后测序数据总条目数（clean reads）不低于44 725 252。使用Trinity对所有样本过滤后数据进行从头组装，并对组装结果进行优化评估，组装得到transcript 221 480条，总长度225 925 112 bp，N50长度1 710 bp，平均长度1 020 bp；获得unigene 123 352条，总长度95 371 340 bp，N50长度1 222 bp，平均长度773 bp，长度1 kb以上的unigene有24 546条。共检测到表达的unigene 121 641条和transcript 218 136条。综上可知，此次转录组测序数据质量较好，满足转录组分析要求。

2.5　差异表达unigene的筛选

光照处理组（G组）与避光处理组（A组）相比，共发现了4 657个显著差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），其中，2 950个基因表达量上调，1 707个基因表达量下调（图2）。

2.6　 Unigene同源性分析

将121 641条表达的unigene与NR数据库基因注释结果进行比对（图2），结果共有56 353条unigene被注释，其中，约69.17%的unigene与同为茜草科（Rubiaceae）的小粒咖啡（Coffea arabica）、丁香咖啡（C. eugenioides）和中粒咖啡（C. canephora）等3种咖啡属植物的基因同源性最高（图3），表明序列注释可靠性较高。

2.7　功能注释分析

使用PlantTFDB数据库鉴定DEGs，共鉴定出185个转录因子，分布于20个转录因子家族中。其中，除HSF家族成员在光处理材料中表达全部下调外，其他家族成员更多表现为表达上调，AP2/ERF家族匹配DEGs最多（35），其次是NAC、MYB_superfamily和bHLH转录因子家族匹配的DEGs（>15）。另外，C2C2及GRAS家族分别匹配了15和14个DEGs，且所有DEGs均呈现表达上调趋势（表5）。

对DEGs进行GO数据库富集分析，结果显示，共有631个GO terms显著富集（P<0.05），其中，富集到生物学过程（biological process，BP）途径中有344个，细胞组分（cellular component，CC）途径中有44个，分子功能（molecular function，MF）途径中有243个。图4中展示了显著富集前20的GO terms，包括3个生物学过程途径（木葡聚糖代谢过程、精氨酸分解代谢过程、对几丁质的反应）、14个分子功能途径（5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-同型半胱氨酸S-甲基转移酶活性、5-甲基四氢蝶酰三-L-谷氨酸依赖性甲基转移酶活性、S-甲基转移酶活性、果胶酯酶抑制剂活性、精氨酸脱羧酶活性、内肽酶调节活性、肽酶抑制剂活性、内肽酶抑制剂活性、醛酮还原酶（NADP）活性、酶抑制剂活性、未折叠蛋白结合、激酶抑制剂活性及氧化还原酶活性、作用于供体CH-OH基团、受体NAD或NADP）和4个细胞组分途径（胞质核糖体小亚基、细胞外间隙、核糖体小亚基及胞质核糖体大亚基）。富集至上述GO terms的DEGs多呈上调趋势，例如分别有18个、12个和20个DEGs显著富集到木葡聚糖代谢过程、果胶酯酶抑制剂活性和细胞外间隙GO terms，其中共有43个DEGs表达上调。

利用KEGG富集分析，进一步探究G组与A组间DEGs的生物学功能，结果如表6所示，共有860个DEGs在25条KEGG通路上显著富集（P-adjust<0.05），其中，核糖体和内质网蛋白质加工通路显著富集，分别有151和89个DEGs富集，远高于其他通路，表明光照处理下种子主要活动与蛋白质合成有关。显著富集KEGG通路中，有苯丙素类生物合成、α-亚油酸代谢、脂肪酸氧化、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、糖酵解/糖异生、精氨酸和脯氨酸代谢、硒化合物代谢、类黄酮生物合成、辅酶因子的生物合成、二萜生物合成、光合生物碳固定、抗坏血酸和醛酸代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、不饱和脂肪酸的生物合成、萜类骨架生物合成、维生素B6代谢、戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化及二苯乙烯、二芳基庚烷和姜辣素生物合成等19个代谢通路，涉及脂质、氨基酸、碳水化合物、萜类化合物和聚酮类化合物的代谢及其他次级代谢产物的生物合成，各通路平均约有23个DEGs富集。MAPK信号通路-植物和植物激素信号转导2个环境信息处理通路分别被49个和65个DEGs显著富集，匹配数量相对较高。此外，昼夜节律-植物和植物-病原菌互作2个有机体系统通路被显著富集。

2.8　 qRT-PCR验证

为验证香果树转录组数据的可靠性，对植物种子萌发过程中常显著富集的GO条目中的8个具有显著差异表达基因进行qRT-PCR，结果显示，4个基因表现为上调，4个基因表现为下调（表7），与转录组内的表达模式基本一致，说明基于RNA-seq技术的香果树DEGs表达水平分析结果可靠。

3 讨论

同一物种植物种子，体积较大者萌发速率相对较小者更快^［23］。香果树种子外形与萌发时间的相关性分析结果表明，其种子萌发时间与种子外部轮廓（含翅）性状无关，但种仁较大者，萌发时间相对较短，这也是导致各光照处理组组内重复间早期萌发率存在一定差异的主要原因之一。推测种仁大的香果树种子，胚可能相对成熟，经短暂的形态后熟即可萌发^［24］，但是否同时伴随生理后熟尚需进一步研究。

本研究结果显示，香果树种子必需经过光照刺激方可萌发，与李铁华等^［6］结论一致。对1 DY组、2 DY*组和2 DY组培养10 d累计萌发率进行比较，发现香果树种子萌发至少需要24 h的光照处理。此外，种子在接受相近时间跨度光照下，累计接受光照时间长者可能更早萌发，这在一定程度上支持了管康林^［14］的结论。对结果综合分析可知，香果树种子的中等萌发率（≥50%），需要≥2 d光照保障，高萌发率（≥80%），需要≥4 d光照保障，6 d光照可满足绝大部分香果树种子萌发需要。

转录组测序结果显示，光照处理2 d，植物热激转录因子（heat shock transcription factor，HSF）家族成员基因均显著下调，表明香果树种子萌发时，耐热能力可能有所下降^［25］，从分子水平解释了李铁华等^［6］发现的香果树种子培养温度升高至35 ℃时发芽率显著低于15~30 ℃萌发率的原因。AP2/ERF转录因子在植物生长发育、应对生物胁迫与非生物胁迫中均发挥着重要作用^［26］，并可通过调节对脱落酸浓度的响应，调控种子萌发过程^［27］。该研究结果显示，光照处理2 d组（G组）与避光处理2 d组（A组）显著差异表达转录因子基因中，AP2/ERF转录因子家族基因最多，且绝大多数上调，表明光诱导萌发处理后，该转录因子家族基因的差异表达可能是诱导香果树种子萌发的主要因素之一。

内肽酶为蛋白水解酶，在下胚轴伸长阶段分解多肽类物质生成氨基酸。这些氨基酸作为新蛋白合成原料，可避免种子萌发早期因无法吸收外界营养而导致的萌发障碍^［28］。因此，内肽酶活性及相关基因表达量，在种子萌发初期显著升高^［29］。GO富集分析结果显示，有15个DEGs显著富集到内肽酶调节活性、肽酶抑制剂活性和内肽酶抑制剂活性3个GO terms。此外，细胞组分（CC）途径和分子功能（MF）途径的胞质核糖体大亚基、胞质核糖体小亚基、酶抑制剂活性、未折叠蛋白结合等GO term被显著富集，表明光照处理2 d，香果树种子蛋白质代谢相关机制已被激活。木葡聚糖为细胞壁的组成成分，占初生细胞壁组分的20%~30%^［30］，种子萌发过程中，其相关代谢及基因表达将影响胚乳和胚胎细胞壁的特性^［31］。果胶同样是构成植物细胞壁的主要成分，在分泌进入细胞壁之前，其主链的半乳糖醛酸结构单元被甲醇高度酯化^［32］，果胶酯酶可催化果胶主链脱甲酯化作用，产生自由的羧基基团，在细胞壁延伸和硬化^［33］、果实成熟^［34］等方面具有重要意义。果胶酯酶抑制剂可抑制果胶酯酶活性，二者相互作用，影响种子萌发过程中细胞壁的性质^［35］。结果显示，富集到木葡聚糖代谢过程、果胶酯酶抑制剂活性和细胞外间隙GO terms的DEGs呈上调趋势，这可能与种子萌发初期细胞分裂及种子萌发过程中胚吸收胚乳细胞营养，细胞间隙逐渐变大有关^［36］。但此结果与香果树种子种仁大小、种仁中胚乳占比及光照处理前胚的发育程度是否有关，尚有待进一步研究。

次生代谢产物的生物合成（ko01110）和核糖体（ko03010）等代谢通路在种子破除休眠过程中发挥重要作用^［37］，本研究中，核糖体（ko03010）通路上显著富集的DEGs数量较多。二萜生物合成（ko00904）和半胱氨酸与甲硫氨酸代谢（ko00270）等代谢途径在植物下胚轴不定根发生过程中被显著富集^［38］。植物-病原菌互作（ko04626）与下胚轴不定根发生的诱导期和启动期容易受病原菌侵染有关^［38］。MAPK信号通路-植物（ko04016）、精氨酸和脯氨酸代谢（ko00330）、植物激素信号转导（ko04075）、二萜生物合成（ko00904）、抗坏血酸和醛酸代谢（ko00053）等代谢通路在植物生长发育及抵抗干旱胁迫过程中起着重要作用^［39］。光照对拟南芥（Arabidopsis thaliana）^［13］、蕨类植物^［40］的孢子或种子的萌发具有一定影响，相关基因主要位于昼夜节律-植物（ko04712）通路中^［40］。分析结果表明，上述通路均被显著富集，表明2 d光照处理可对香果树种子胚进一步发育及种苗抗逆性等萌发相关性状带来极大影响。

4 结论

香果树种子萌发具有光照依赖性，需要至少24 h跨度的光照刺激才能萌发。种仁性状与种子萌发时间之间存在显著相关性。香果树种子萌发初期，通过对HSF和AP2/ERF转录因子家族、胚乳代谢、下胚轴发育及种苗环境适应性等相关基因的调节来响应光照刺激，为种子后续萌发提供保障，但具体作用机制尚不清晰，有待进一步深入研究。

参考文献

[1] 郭连金.濒危植物香果树幼苗空间格局及数量动态研究［J］.西北植物学报，2014，34（9）：1887-1893.

[2] GUO L J.Spatial distribution pattern and number dynamics of Emmenopterys henryi seedlings endangered in China［J］.Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，2014，34（9）：1887-1893.

[3] MANCHESTER S R， CHEN Z D， LU A M，et al.Eastern Asian endemic seed plant genera and their paleogeographic history throughout the Northern Hemisphere［J］.Journal of Systematics and Evolution，2009，47（1）：1-42.

[4] 金雅琴，陶积松，王德满，等.河南连康山自然保护区香果树种群结构与分布格局研究［J］.生态与农村环境学报，2022，38（1）：52-60.

[5] JIN Y Q， TAO J S， WANG D M，et al.Population structure and spatial distribution pattern of Emmenopterys henryi in Liankang Mountain Natural Reserve，Henan Province［J］.Journal of Ecology and Rural Environment，2022，38（1）：52-60.

[6] CHEN W D， WEI J， ZHU K，et al.Predicting potential distribution of Emmenopterys henryi in Southwest China based on the MaxEnt model and influencing factors［J］.Tropical Ecology，2022，63（4）：572-583.

[7] CAI H W， ZHANG G F.Predicting the potential distribution of rare and endangered Emmenopterys henryi in China under climate change［J］.Ecology and Evolution，2024，14（10）：e70403.

[8] 李铁华，周佑勋，段小平，等.香果树种子休眠和萌发的生理特性［J］.中南林学院学报，2004，24（2）：82-84.

[9] LI T H， ZHOU Y X， DUAN X P，et al.Physiological characteristics of the dormancy and light-sensitive germination of Emmenopterys henyi seeds［J］.Journal of Central South Forestry University，2004，24（2）：82-84.

[10] 陈茂光，郭连金，余诺祎，等.林下枯落物浸提液对香果树种子萌发及幼苗生长影响的化感效应［J］.陕西林业科技，2019，47（4）：1-7.

[11] CHEN M G， GUO L J， YU N Y，et al.Allelopathic effects of extracts from litters in forest on seed germination and seedling growth of Emmenopterys henryi ［J］.Shaanxi Forest Science and Technology，2019，47（4）：1-7.

[12] FENG Y Y， HAO Y F， CAI L J，et al.Influence of trehalose on photosynthesis in the rare and endangered Emmenopterys henryi Oliv.during heat stress and recovery process［J］.Acta Physiologiae Plantarum，2022，44：8.

[13] HAO Y F， FENG Y Y， CAI L J，et al.Effect of ABA on photosynthesis and chlorophyll fluorescence in Emmenopterys henryi Oliv.under high light［J］.Russian Journal of Plant Physiology，2021，68（3）：510-518.

[14] 郭连金，曹昊玮，徐卫红，等.香果树（Emmenopterys henryi）种群种子雨、种子库及实生苗数量的海拔梯度变化［J］.植物研究，2017，37（3）：377-386.

[15] GUO L J， CAO H W， XU W H，et al.Seed rain，soil seed bank and quantitative dynamics of seedlings of Emmenopterys henryi populations in different altitude regions［J］.Bulletin of Botanical Research，2017，37（3）：377-386.

[16] 康华靖，陈子林，刘鹏，等.大盘山自然保护区香果树种群结构与分布格局［J］.生态学报，2007，27（1）：389-396.

[17] KANG H J， CHEN Z L， LIU P，et al.The population structure and distribution pattern of Emmenopterys henryi in Dapanshan Natural Reserve of Zhejiang Province［J］.Acta Ecologica Sinica，2007，27（1）：389-396.

[18] GUO L J， XUE P P， LI M，et al.Seed bank and regeneration dynamics of Emmenopterys henryi population on the western side of Wuyi Mountain，South China［J］.Journal of Forestry Research，2017，28（5）：943-952.

[19] 王雅寒，刘勋成.光调控植物种子萌发分子机制研究进展［J］.热带亚热带植物学报，2024，32（2）：294-300.

[20] WANG Y H， LIU X C.Research progress of the molecular mechanisms of light-regulated plant seed germination［J］.Journal of Tropical and Subtropical Botany，2024，32（2）：294-300.

[21] 管康林.香果树种子的光萌发特性初步研究［J］.浙江林学院学报，1985，2（2）：47-50.

[22] GUAN K L.Study on the light demanding germination of the seed of Emmenopterys henryi Oliv.［J］.Journal of Zhejiang Forestry College，1985，2（2）：47-50.

[23] 郑知临，曹红利，王鹏杰，等.茶树种子发育过程的转录组分析［J］.西北植物学报，2019，39（9）：1534-1542.

[24] ZHENG Z L， CAO H L， WANG P J，et al.Transcriptomics analysis of Camellia sinensis seed in three different development stages［J］.Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，2019，39（9）：1534-1542.

[25] 闫宗圣，王乾，王蕾，等.白鲜种子休眠解除过程中的转录组分析［J］.种子，2022，41（12）：35-40.

[26] YAN Z S， WANG Q， WANG L，et al.Transcriptome analysis of dormancy release in Dictamnus dasycarpus Turcz.seeds［J］.Seed，2022，41（12）：35-40.

[27] PAN C L， YAO L X， YU L Y，et al.Transcriptome and proteome analyses reveal the potential mechanism of seed dormancy release in Amomum tsaoko during warm stratification［J］.BMC Genomics，2023，24：99.

[28] CHEN T T， CHEN X， ZHANG S S，et al.The genome sequence archive family：toward explosive data growth and diverse data types.Genomics Proteomics & Bioinformatics，2021，19（4）：578-583.

[29] 冯玥，郭嘉，解增言.植物种子特异基因调控网络研究［J］.基因组学与应用生物学，2021，40（3）：1307-1315.

[30] FENG Y， GUO J， XIE Z Y.Study on regulatory network of seed-specific genes［J］.Genomics and Applied Biology，2021，40（3）：1307-1315.

[31] 白雪，曹帅，向殿军，等.低温条件下蓖麻种子萌发期转录组分析［J］.分子植物育种，2019，17（12）：3834-3844.

[32] BAI X， CAO S， XIANG D J，et al.Transcriptome analysis of castor seeds at germination stage under low temperature［J］.Molecular Plant Breeding，2019，17（12）：3834-3844.

[33] 索荣臻.大豆萌发期低温、渍水及联合胁迫的全基因组关联分析与候选基因挖掘［D］.呼和浩特：内蒙古农业大学，2023.

[34] SUO R Z.Genome-wide association analysis and candidate gene associated with low temperature，waterlogging and combined stresses during soybean germination［D］.Hohhot：Inner Mongolia Agricultural University，2023.

[35] 牛晓雪，李保华，包艳存，等.不同采收期芦笋种子质量及转录组学分析［J/OL］.分子植物育种.（2023-03-21）［2025-03-25］.

[36] NIU X X， LI B H， BAO Y C，et al.Study on seed quality and transcriptome analysis of Asparagus officinalis L.in different harvesting period［J/OL］.Molecular Plant Breeding.（2023-03-21）［2025-03-25］.

[37] JONES L R， HUNTS C A， DOLAN L A，et al.Effects of seed size and toucan regurgitation on the germination of the tropical tree Eugenia uniflora ［J］.Journal of Tropical Ecology，2023，39：e5.

[38] 杨期和，叶万辉，宋松泉，等.植物种子休眠的原因及休眠的多形性［J］.西北植物学报，2003，23（5）：837-843.

[39] YANG Q H， YE W H， SONG S Q，et al.Summarization on causes of seed dormancy and dormancy polymorphism［J］.Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，2003，23（5）：837-843.

[40] GAI W X， YANG F，ALI M，et al.Pepper heat shock transcription factor A1d contributes to seed thermotolerance and germination vigor［J］.Scientia Horticulturae，2023，311：111786.

[41] FENG K， HOU X L， XING G M，et al.Advances in AP2/ERF super-family transcription factors in plant［J］.Critical Reviews in Biotechnology，2020，40（6）：750-776.

[42] CHEN H Y， HSIEH E J， CHENG M C，et al.ORA47 （octadecanoid-responsive AP2/ERF-domain transcription factor 47） regulates jasmonic acid and abscisic acid biosynthesis and signaling through binding to a novel cis-element［J］.New Phytologist，2016，211（2）：599-613.

[43] RAJJOU I， DUVAL M， GALLARDO K，et al.Seed germination and vigor［J］.Annual Review of Plant Biology，2012，63（1）：507-533.

[44] 曲春浦，张国壁，左壮，等.杨树种子萌发中内肽酶变化及其相关途径基因的表达模式［J］.贵州农业科学，2018，46（9）：1-6.

[45] QU C P， ZHANG G B， ZUO Z，et al.Change of endopeptidase and expression pattern of related pathway genes during germination of poplar seeds［J］.Guizhou Agricultural Sciences，2018，46（9）：1-6.

[46] 王庆吉延，李金，李田，等.‘燕山红栗’雌花不同发育阶段解剖结构及细胞壁成分变化［J］.植物研究，2024，44（5）：670-680.

[47] WANG Q J Y， LI J， LI T，et al.Anatomical structure and cell wall components changes in Chestnut ‘Yanshan Hongli’ female flowers at developmental stages［J］.Bulletin of Botanical Research，2024，44（5）：670-680.

[48] SANGI S， SANTOS M L C， ALEXANDRINO C R，et al.Cell wall dynamics and gene expression on soybean embryonic axes during germination［J］.Planta，2019，250（4）：1325-1337.

[49] 梅晓宏，陈燕卉，高红岩，等.果胶甲酯酶抑制剂的研究进展［J］.食品科技，2008（6）：64-68.

[50] MEI X H， CHEN Y H， GAO H Y，et al.Development of pectin methylesterase inhibitor［J］.Food Science and Technology，2008（6）：64-68.

[51] SANTI L， BEYS-DA-SILVA W O， BERGER M，et al. Penicillium oxalicum secretomic analysis identify plant cell wall degrading enzymes important for fruit juice extraction［J］.Journal of Food Science，2021，58（5）：1764-1775.

[52] ZHANG X， TANG H M， DU H，et al.Comparative N-glycoproteome analysis provides novel insights into the regulation mechanism in tomato （Solanum lycopersicum L.） during fruit ripening process［J］.Plant Science，2020，293：110413.

[53] SHARMIN R A， BHUIYAN M R， LV W H，et al.RNA-Seq based transcriptomic analysis revealed genes associated with seed-flooding tolerance in wild soybean （Glycine soja Sieb.& Zucc.）［J］.Environmental and Experimental Botany，2020，171：103906.

[54] 陆沁怡，沈永宝，史锋厚.芍药种胚发育及物质代谢的探究［J/OL］.分子植物育种.（2022-05-18）［2023-10-13］.

[55] LU Q Y， SHEN Y B， SHI F H.Study on embryo development and material metabolism of Paeonia lactiflora Pall.［J/OL］.Molecular Plant Breeding.（2022-05-18）［2023-10-13］.

[56] 罗丽娜，向增旭.基于转录组测序分析的黄精种子休眠解除相关差异基因研究［J］.中国农学通报，2021，37（11）：1-8.

[57] LUO L N， XIANG Z X.The relative difference genes in the process of dormancy release of Polygonatum sibiricum Red.based on the transcriptome sequencing analysis［J］.Chinese Agricultural Science Bulletin，2021，37（11）：1-8.

[58] 张焕欣，董春娟，尚庆茂.辣椒下胚轴不定根发生相关差异表达基因分析［J］.植物生理学报，2017，53（8）：1553-1568.

[59] ZHANG H X， DONG C J， SHANG Q M.Differential expression analysis of genes involved in adventitious rooting from pepper （Capsicum annuum） hypocotyl cuttings［J］.Plant Physiology Journal，2017，53（8）：1553-1568.

[60] 庄卉卉.黄花棘豆响应非生物胁迫转录组分析及干旱胁迫信号通路的研究［D］.西安：西北大学，2016.

[61] ZHUANG H H.Analysis of Oxytropis ochrocephala Bunge transcriptome in response to abiotic stresses and the signaling pathway involved in drought［D］.Xi'an：Northwest University，2016.

[62] OSPINA K R， BRIONES O， PÉREZ-GARCÍA B.Spore germination of three tree fern species in response to light，water potential，and canopy openness［J］.American Fern Journal，2015，105（2）：59-72.

基金资助

国家自然科学基金地区科学基金项目(32060336)

国家自然科学基金地区科学基金项目(31860200)

国家自然科学基金地区科学基金项目(31360145)

江西省教育厅科学技术研究项目(GJJ211719)

江西省教育厅科学技术研究项目(GJJ211723)