拟南芥细胞组蛋白分子伴侣HIRA对增强UV-B辐射的响应

Response of Arabidopsis thaliana Histone Chaperone HIRA to Enhanced UV-B Radiation

摘要

UV-B辐射对植物生长有显著抑制作用，导致根系短小和DNA损伤。研究发现，组蛋白分子伴侣HIRA（HISTONE REGULATOR A）在染色质相关的DNA损伤修复中发挥作用。该研究以哥伦比亚生态型拟南芥（Arabidopsis thaliana）及hira突变体为材料，比较对照组（-UV-B）和UV-B处理组（+UV-B）的表型及生理指标，结果显示：HIRA基因缺失导致拟南芥根系变短、植株矮小。UV-B处理后，hira突变体的根长显著短于野生型，根部活性氧和丙二醛含量增加，而根部可溶性蛋白质含量和叶片叶绿素含量下降。拟南芥遗传转化亚细胞定位结果显示，HIRA定位于细胞核，UV-B辐射引发突变体根尖分生区细胞出现染色体桥和异常有丝分裂。进一步研究结果表明，UV-B辐射显著上调了DNA损伤修复基因的表达。综上，UV-B辐射下，HIRA参与拟南芥根尖细胞有丝分裂及损伤修复过程。

Abstract

UV-B radiation significantly inhibits plant growth， leading to short roots and DNA damage. Research has shown that the histone chaperone HIRA（HISTONE REGULATOR A） plays a role in chromatin-related DNA damage repair. In this study， using the Columbia ecotype of Arabidopsis thaliana and the hira mutant as materials， the comparison of phenotypic and physiological indicators between the control group （-UV-B） and the UV-B treatment group（+UV-B） revealed that the absence of the HIRA gene led to shorter roots and smaller plants in A. thaliana. After UV-B treatment， the roots of hira mutant were significantly shorter than those of the wild type， with increased levels of reactive oxygen species and malondialdehyde， and decreased levels of soluble protein and chlorophyll. Subcellular localization of A. thaliana transformation showed that HIRA was located in the nucleus. UV-B radiation caused chromosome bridges and abnormal mitosis in the root tip meristematic zone cells of the mutant. Further research results indicated that UV-B radiation significantly upregulated the expression of DNA damage repair related genes. In conclusion， HIRA was involved in the process of cell mitosis and damage repair under UV-B radiation.

Graphical abstract

关键词

组蛋白分子伴侣 / UV-B / 异常有丝分裂 / DNA损伤修复

Key words

histone chaperone HIRA / UV-B / abnormal mitosis / DNA damage repair

太阳紫外辐射（UV）根据波长通常可分为3类：超强效应波（UV-C，200~280 nm）、强效应波（UV-B，280~320 nm）和弱效应波（UV-A，320~400 nm）^［1］。人类活动范围扩大与强度的不断增加导致臭氧层受到的破坏程度也在提高，使得地球表面受到的紫外线B（ultraviolet B，UV-B）辐射增强。UV-B辐射在植物生命中起着双重作用，既是环境应激源，又是发育信号^［2］，作用表现为抑制下胚轴伸长和子叶扩张，同时促进类黄酮积累^［3］。然而，植物暴露于高强度的UV-B下会导致DNA损伤、膜组分改变、蛋白质交联和活性氧（ROS）的形成，从而导致氧化应激^［4］。同时，受UV-B辐射后，调控植物细胞生长发育的DNA区域受到损伤，影响细胞周期进程，导致核内复制，引起细胞分裂、伸长和分化的变化，细胞分裂受到抑制，细胞数量也随之减少^［5］，抑制植物的生长和代谢。韩榕^［1］的研究结果表明，UV-B辐射后小麦（Triticum aestivum）根尖细胞DNA受到损伤，表现出翘根现象及分束分裂和染色体畸变等异常有丝分裂现象。细胞分裂是生物体生长繁殖的基础^［6］。UV-B辐射导致的DNA损伤主要通过同源重组^［7］和非同源末端连接^［8］的方式进行修复。此外，还有其他DNA修复方式，例如，SOS修复^［9］、二聚体旁路、细胞周期检查点调控^［10］、细胞凋亡^［11］等。

HIRA（HISTONE REGULATOR A）编码的蛋白质是H3-H4组蛋白分子伴侣，在DNA损伤修复中发挥着重要作用。HIRA作为一种组蛋白调节因子，主要负责组蛋白H3.3的转运和替换，从而影响染色质的结构和功能，它可以将组蛋白H3.3替换到受损DNA区域，促进染色质的重塑。这一过程使修复酶更容易接触到损伤部位，对于DNA修复至关重要。在动物细胞中，组蛋白H3.3会通过特定的蛋白质复合体沉积到染色质中。有研究^［12-13］表明，通过掺入组蛋白H3.3进行染色质标记是激活或长期维持基因表达模式所必需的。在裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中，HIRA复合体的丢失会导致其对DNA损伤剂的敏感性提高，这一发现证实了HIRA复合体在保护细胞免受DNA双链断裂（DNA double strand break，DSB）侵害方面发挥作用^［14］。HIRA在DNA损伤位点早期沉积组蛋白H3.3，是染色质修复和转录重新激活的必要步骤。HIRA的这一作用被认为是一种“染色质标记”机制，为后续基因活性恢复提供信号。组蛋白H3.3的沉积和染色质的开放状态是转录恢复的前提，而HIRA作为H3.3的组蛋白伴侣，直接促进这一过程^［15］。目前，HIRA蛋白在植物中的研究还不够深入。在植物细胞营养繁殖之前的去分化过程中，HIRA功能是转录重新编程所必需的，也是对生物和非生物因素做出反应的基因转录所必需的^［16］。HIRA主要介导组蛋白H3.3变体在转录染色质区域的沉积^［13］。在植物根部，HIRA功能丧失还会影响响应基因的表达。HIRA与Hip1和SLm9同源，与多个DNA修复通路相关，包括同源重组修复（HR）和非同源末端连接（NHEJ）^［14］。在这些修复过程中，HIRA通过调节组蛋白的修饰和定位，促进修复蛋白的聚集和激活。HIRA已被证明在DNA双链断裂后的染色质重组和哺乳动物细胞暴露在紫外线应激后的转录恢复中发挥作用^［17］，但是HIRA在DNA损伤修复中的实际功能尚不清楚。

本研究通过构建转基因恢复株系（HIRA/hira），检测AtHIRA的亚细胞定位，分析增强UV-B辐射处理后各组幼苗表型，并比较UV-B胁迫前后野生型、突变体、恢复株系的形态及生理生化指标变化，进一步观察突变体在UV-B胁迫下的染色体畸变现象，研究拟南芥细胞组蛋白分子伴侣HIRA对增强UV-B辐射的响应。

1 材料与方法

1.1　材料及培养

本研究所用的野生型拟南芥种子均为哥伦比亚生态型拟南芥（Col-0），由植物大分子逆境响应山西省重点实验室保存。Col-0背景下T-DNA插入的hira突变体（SALK_024812C）购自福州爱若莎生物科技有限公司。转基因marker株系H2B-YFP由山西师范大学冯金林副教授惠赠。植物表达载体pCAMBIA1300-mCherry为本课题组保存，购自武汉淼灵生物科技有限公司。

拟南芥培养：将拟南芥种子置于冰箱中4 ℃处理3 d，用体积分数75%乙醇和1.5%的次氯酸钠进行表面消毒杀菌，再用灭菌水清洗。将培养基板竖直放置在恒温培养箱中，光照培养条件为16 h/8 h（光/暗），温度为（20±2） ℃。

UV-B辐射剂量：对正常光照下生长5 d的拟南芥幼苗进行UV-B辐射处理，UV-B光源购自南京华强电子有限公司，UV-B辐射剂量5.04 kJ·m^-2，连续辐照处理2 d。

1.2　 pCAMBIA1300：：HIRA-mCherry载体的构建及亚细胞定位

1.2.1　pCAMBIA1300：：HIRA-mCherry载体的构建

在NCBI数据库搜索HIRA基因上游1 760 bp的启动子，设计引物（附表1，参见本刊官网补充材料），以野生型拟南芥幼苗DNA为模板，使用Phusion DNA Polymerase酶（全式金，中国）扩增目的基因。切胶回收。以切胶回收的目的基因DNA为模板扩增插入的片段，切胶回收。用EcoRⅠ-HF（NEB，美国）对pCAMBIA1300-mCherry空载体进行酶切，切胶回收。酶切载体和插入片段进行重组反应。使用热激法将重组产物连接到大肠杆菌（Escherichia coli）TOP10（全式金，中国）。将生长出的大肠杆菌单菌落进行菌液PCR验证，送往上海生物工程有限公司测序。在NCBI数据库比对获得的测序结果与已知的基因序列。

1.2.2　亚细胞定位

将成功构建的载体转化农杆菌，加YEB液体培养基（含利福平），在28 ℃、200 r·min^-1培养4 h，10 000 r·min^-1离心30 s，弃上清液。加入YEB液体培养基（含利福平）重悬沉淀，随后将重悬液涂于YEB固体培养基（含硫酸卡那霉素、利福平），28 ℃培养2 d。挑取单菌落加YEB液体培养基（含硫酸卡那霉素、利福平），28 ℃下200 r·min^-1摇菌至橙色，保菌，置于超低温冰箱中-80 ℃保存备用。

重悬菌液，OD₆₀₀为0.5~0.6，室温黑暗静置3 h后，将其注射到烟草叶片中，同时注射核信号物质（pSuper1300-RAD21.3-GFP）。黑暗培养2 d，用激光共聚焦扫描显微镜（Olympus，日本）观察烟草叶片的瞬时表达。

浸花法对拟南芥进行转染。在1/2MS培养基（含潮霉素）固体板上筛选阳性苗。在激光共聚焦扫描显微镜下对拟南芥根尖进行亚细胞定位观察。

1.3　增强UV-B辐射下拟南芥根长及生理指标测定

对增强UV-B辐射下拟南芥根长进行数据统计分析。利用化学染色法分析活性氧含量。参照林艳等^［18］的方法稍加修改测定丙二醛含量：称取0.2 g样品，加石英砂和预冷的10% TCA，充分研磨，在4 ℃、5 000 r·min^-1下离心10 min，弃沉淀，加体积分数0.6%的TBA溶液充分混合后，在沸水中处理15 min，450、532、600 nm下测定样本吸光度。参照Guo等^［19］的方法稍加修改提取叶绿素：称取0.14 g叶片，浸泡于95%乙醇中，25 ℃下黑暗处理，在645、663 nm下测得样本吸光度。可溶性蛋白提取、测定^［20］：取0.1 g样品，加2 mL去离子水研磨成匀浆，在4 ℃、10 000 r·min^-1条件下离心10 min后吸取上清液，加5 mL考马斯亮蓝溶液，充分混匀后，在595 nm下测定样本OD值。

1.4　增强UV-B辐射下拟南芥 hira 突变体根尖分生区细胞有丝分裂分析

以hira突变体为母本，H2B-YFP株系为父本进行杂交，选取生长6 d的幼苗，利用激光共聚焦扫描显微镜（Olympus，日本）在YFP激发波长514 nm、发射波长527~530 nm下，通过H2B-YFP信号观察hira/H2B-YFP幼苗根尖分生区细胞有丝分裂和UV-B胁迫下的染色体畸变类型。

1.5　增强UV-B辐射下拟南芥根尖DNA损伤修复分析

提取拟南芥根尖RNA，反转录cDNA以ACTIN为内参基因进行qRT-PCR（附表1，参见本刊官网补充材料），测定相关基因表达量。参照Han等^［21］的方法稍加修改测定EdU（5-乙炔基-2′-脱氧尿苷）活性：在MS液体培养基（含10 μmol·L^-1的EdU）中培育幼苗30 min，再用PBS（含3.7%甲醛）固定30 min，BSA清洗液清洗3次，每次5 min。PBS（含0.5%Triton X-100）处理幼苗15 min，用BSA清洗液清洗3次，每次5 min。按Cell Proliferation EdU Imega Kit（KTA2030，Abbkine，中国）试剂盒说明书配制Click-iT反应混合物，室温避光处理4 h。用BSA清洗液清洗后，利用激光共聚焦扫描显微镜进行观察。

1.6　图像采集和数据处理

采用奥林巴斯BX53荧光显微镜（Olympus，日本）、奥林巴斯FV-1000激光共聚焦扫描显微镜（Olympus，日本）采集图像和试验数据，GFP绿色荧光激发波长为488 nm，发射波长为500~545 nm；mCherry红色荧光激发波长为594 nm，发射波长为570~670 nm。所有检测指标均设置3次重复。利用ImageJ分析图像，利用GraphPad Prism 9分析各组显著性差异并绘图。

2 结果与分析

2.1　 hira 突变体的鉴定与表型分析

为获得hira纯合突变体，利用三引物法对hira突变体进行DNA水平鉴定（图1A），使用2组引物：hira-LP与hira-RP、LBb1.3与hira-RP。水（1/1′）为阴性对照，野生型WT（2-3/2′-3′）为阳性对照，WT扩增的片段约为1 088 bp，突变体样本4-5（hira-LP+hira-RP）及4′-5′（LBb1.3+hira-RP）扩增的片段约为561 bp，表明该突变体在DNA水平上鉴定为纯合。同时，提取幼苗RNA，利用RT-PCR技术进行RNA水平鉴定（图1B），内参基因EF1a在WT和hira突变体中的表达量相同，而HIRA基因在突变体的表达量低于WT中的表达量，表明该突变体在RNA水平上鉴定为纯合，与DNA水平鉴定结果一致。

与野生型WT相比，hira突变体的根系明显变短，但HIRA/hira恢复株系的根长明显得到了恢复，且与WT无明显差异（图2A、2D），说明HIRA基因缺失会导致hira突变体的根系变短。对生长8 d的植株叶面积测定结果（图2B、2E）表明，hira突变体莲座叶叶面积相较于WT明显减小，说明HIRA基因缺失会导致叶面积变小。hira突变体抽薹时间相较于WT较早（图2C）。在生殖生长前期，hira突变体株高相较于WT更高，但在生殖生长后期，hira突变体株高与WT无明显差异（图2F、2G）。

2.2　根尖分生区长度和细胞数目统计分析

PI荧光染色结果显示（图3A）：MZ（分生区）细胞呈紧密排列的正方形，EZ（伸长区）细胞显著伸长；蓝色箭头标注的QC（静止中心）位于分生区顶端，白色箭头所示为分生区-伸长区过渡带，细胞开始膨大但未完全伸长。hira根尖分生区长度相较于WT明显缩短（图3B），细胞数目明显减少（图3C），说明hira根系变短是由于根尖分生区长度和细胞数目减少所导致的。

2.3　 HIRA的亚细胞定位分析

2.3.1　烟草瞬时表达

瞬时表达^［22］是指将外源基因以非整合的方式导入细胞，在短时间内实现目的基因高水平表达的技术。共聚焦结果如图4所示，HIRA融合的mCherry荧光与核信号（pSuper1300-RAD21.3-GFP）荧光共定位，表明HIRA定位在细胞核中。

2.3.2　拟南芥根尖AtHIRA亚细胞定位

通过eplant网站预测亚细胞定位，结果显示，AtHIRA定位于细胞核中。使用激光共聚焦扫描显微镜观察HIRA/hira的根尖分生区细胞（图5），结果表明，在拟南芥根尖中HIRA定位于细胞核中。

2.4　增强UV-B辐射对拟南芥根生长及生理指标的影响

2.4.1　增强UV-B辐射对拟南芥根长的影响

hira幼苗在UV-B处理前后根长的减少率显著高于WT（图6），HIRA/hira在UV-B处理前后根长的减少率与WT相比无显著差异。据此推测，增强UV-B辐射后HIRA基因的缺失导致突变体的根系受损加重，从而导致根系更短。

2.4.2　增强UV-B辐射对拟南芥生理生长的影响

UV-B处理后，hira的染色程度明显高于WT（P<0.05），hira的超氧阴离子含量和过氧化氢含量都显著增加（图7）。增强UV-B辐射处理后，拟南芥根中MDA含量显著高于对照组，hira突变体MDA含量与WT相比显著提高（P<0.05），说明增强UV-B辐射下，HIRA基因的缺失可能会引起ROS积累，从而导致细胞膜受损更严重。UV-B胁迫前，hira突变体可溶性蛋白含量较WT植株显著下降（P<0.05）（图7F）；UV-B胁迫后，hira突变体的可溶性蛋白含量与WT相比下降更明显（P<0.05），说明UV-B胁迫下，HIRA基因缺失使可溶性蛋白合成受阻，最终影响植株的生长发育。UV-B辐射处理前后，hira突变体的叶绿素含量显著低于WT（P<0.05），并且叶绿素b含量比叶绿素a含量下降更显著（图7G~7I）。上述结果表明，HIRA基因的缺失可能会抑制叶绿素b合成，进而影响植物光合作用。

2.5　增强UV-B辐射对拟南芥根尖细胞有丝分裂的影响

拟南芥根尖分生区细胞正常有丝分裂时期如图8所示。增强UV-B辐射处理后，hira根尖分生区细胞出现微核（图9A）、染色体桥（图9B）、落后染色体（图9C）、游离染色体（图9D）、赤道板偏转（图9E、9F）、多束分裂（图9G）和不等分裂（图9H）等现象，说明在UV-B胁迫下，HIRA基因的缺失会影响正常的细胞有丝分裂过程。

2.6　增强UV-B辐射对拟南芥DNA损伤修复的影响

增强UV-B处理后，与对照组相比，WT和hira突变体中RAD51和RAD54基因的表达量均呈现上调趋势（图10），并且hira突变体中的表达量明显高于WT（P<0.05），说明HIRA可能参与UV-B胁迫下的拟南芥DNA损伤修复。

为了进一步研究HIRA在UV-B胁迫处理的拟南芥中参与DNA损伤修复途径，通过EdU荧光标记DNA的合成（图11）。结果显示，增强UV-B辐射处理前，WT、hira和HIRA/hira的EdU活性无显著差异，增强UV-B辐射处理后，三者的EdU活性都明显降低，其中，hira的EdU活性与WT相比显著增强（P<0.05）。

3 讨论

本研究在转基因植株根尖的分生区发现AtHIRA基因定位于细胞核中。在对hira突变体的表型分析中发现，HIRA基因的缺失会对拟南芥的生长发育造成影响，表现为根系变短，植株矮小，根尖分生区长度和细胞数目减少^［23-24］。比较分析野生型、突变体和恢复株系在增强UV-B辐照前后的变化，结果表明，UV-B胁迫下hira根长受抑制明显并且根尖分生区长度显著小于对照，可溶性蛋白含量、叶绿素含量均低于对照。胁迫条件下，植物器官中活性氧过度积累会导致严重的膜脂过氧化损伤^［25-26］。UV-B辐照胁迫已被广泛证实会引发植物器官中产生过量的活性氧，从而导致细胞膜脂氧化胁迫。本研究中，UV-B辐照导致拟南芥中MDA含量增加，可溶性蛋白含量降低。UV-B辐照下，植物器官中可溶性蛋白含量的显著下降可能与活性氧的积累有关，因为氧化胁迫可能引发蛋白质的降解和变性。这些变化可能通过影响根部细胞的代谢与生长调控机制，削弱了根系正常的代谢活动^［27］，从而抑制根系发育。同时，UV-B辐射产生的活性氧会影响叶绿素的生物合成和降解过程，从而降低植物叶绿素含量，进而影响植物的光合作用^［28］。自然环境中，UV-B辐射既是一种胁迫因子，也是一种信号分子，参与植物代谢的各个方面。UV-B辐射对植物生理生化不同水平的影响，是一系列信号转导调节基因表达的结果，整个调节过程完整而有序^［29］。作为植物生命的基础，根系的生长发育机制较为复杂。增强UV-B辐射造成hira突变体根系变短的现象与上述因素的具体关系还需要进一步探究。

HIRA介导组蛋白H3.3在转录染色质区域的沉积^［30-31］，其缺失会降低细胞H3组蛋白的含量。有研究^［32］表明，HIRA在细胞周期控制中发挥作用。HIRA和DAXX是2个组蛋白伴侣蛋白^［33］，在细胞周期的所有阶段参与新合成的组蛋白H3.3的核小体组装^［33-34］。HIRA可能在控制细胞周期调节的组蛋白转录和染色质组装方面具有双重功能^［35］。UV-B胁迫下，细胞会发生异常有丝分裂现象，出现染色体畸变^［1］。HIRA基因参与细胞有丝分裂过程。在本研究关于HIRA基因缺失是否会对UV-B胁迫下的正常有丝分裂造成影响的试验中，利用组蛋白H2B-YFP株系，观察hira突变体根细胞分裂时期的染色体分裂情况，结果表明，HIRA基因缺失会对拟南芥根细胞正常的有丝分裂过程造成影响，出现染色体畸变，如染色体桥、微核、多束分裂、赤道板偏转等。在UV-B胁迫下，HIRA基因的缺失会影响正常的细胞有丝分裂过程。这可能是由于AtHIRA基因缺失影响了H3.3组蛋白变体在转录染色质区域的沉积^［15-30］，导致染色体在细胞分裂过程中未能准确平均地分配到子细胞中。染色体畸变率提高可能是DNA损伤增加的结果，但UV-B辐射下，HIRA影响拟南芥根细胞有丝分裂的分子机制还有待进一步探究。

HIRA在紫外辐射应激后的转录恢复中发挥作用^［36］。有研究^［37］表明，有效的DNA损伤修复需要染色质重塑。本研究用荧光定量PCR检测了DNA损伤修复Marker基因的表达量，结果表明，在UV-B胁迫下，hira突变体中RAD51和RAD54的表达量显著上调，表明HIRA基因可能参与了UV-B胁迫下拟南芥DNA损伤修复过程。这与Zhu等^［38］的研究结果一致。RAD51作为同源重组修复过程中的关键酶，可介导双链断裂DNA的修复。本研究发现，HIRA基因缺失会激活植物体内的DNA修复通路，显著上调RAD51和RAD54的表达量，进而增强对UV-B辐射损伤的修复能力。为探究HIRA在UV-B胁迫下参与DNA损伤修复机制，通过EdU荧光标记技术检测DNA合成活性，结果显示，UV-B处理后，hira突变体的EdU活性显著增强，表明HIRA基因可能参与了DNA合成。DNA损伤修复主要依赖同源重组修复和切除修复2种途径，且二者均伴随非按期DNA合成。由于hira突变体中同源重组关键基因的表达上调，推测HIRA可能通过促进DNA合成参与UV-B辐射后的损伤修复，且其作用位点可能与同源重组修复过程相关，但HIRA在UV-B胁迫下调控DNA修复的分子机制仍需进一步研究验证。

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基金资助

国家自然科学基金面上项目(30671061)