具核梭杆菌经铁死亡途径破坏体外肠道上皮屏障模型的研究

摘要

目的 探究具核梭杆菌（F. nucleatum）感染对体外肠道上皮屏障的影响及可能的机制。方法 人结直肠腺癌细胞Caco-2细胞接种于Transwell小室构建体外肠道上皮屏障模型。采用葡聚糖硫酸钠（DSS）和F. nucleatum建立细胞损伤和感染模型，实验分为CON组、FN组、8%DSS组和FN+8%DSS组，检测F. nucleatum对有无DSS处理的上皮屏障的影响并评估铁死亡在其中的作用；随后引入铁死亡抑制剂铁抑素1 (Fer-1)和去铁胺（DFO），探究抑制铁死亡对受损上皮屏障的作用。实验中，采用细胞计数试剂盒8 (CCK-8)检测细胞增殖；乳酸脱氢酶（LDH）法检测细胞损伤；跨上皮电阻值（TEER）评估上皮完整性；异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FD4）透过率评估上皮通透性；透射电镜观察细胞间连接及线粒体；蛋白免疫印迹和免疫荧光染色检测胞质紧密粘连蛋白ZO-1和紧密连接蛋白CLDN-1的表达；铁死亡检测包括免疫荧光染色检测细胞内亚铁离子（Fe2+）含量；免疫印迹法检测谷胱甘肽过氧化物酶4 (GPX4)、铁蛋白重链1 (FTH1)、乙酰辅酶A合成酶长链家族4 (ACSL4)的表达，以及测量丙二醛（MDA）含量和谷胱甘肽比例（GSH%）评估脂质过氧化水平。结果 与CON组相比，FN组、8%DSS组和FN+8%DSS组细胞增殖率降低，细胞损伤增加（P<0.05）；与CON组相比，FN组TEER值和FD4透过率差异无统计学意义（P>0.05）；与8%DSS组相比，FN+8%DSS组的6、12、24 h TEER值下降（P<0.05）,FD4透过率增加（P<0.000 1）；与CON组相比，FN+8%DSS组ZO-1和CLDN-1蛋白下调（P<0.05）；透射电镜观察到8%DSS组细胞间连接破坏，FN+8%DSS组除了细胞间连接破坏还观测到F. nucleatum入侵细胞内部，线粒体呈现铁死亡样改变；GPX4蛋白下调，FTH1和ACSL4蛋白上调，细胞内Fe2+积聚，MDA升高，GSH%降低。引入Fer-1和DFO后，细胞损伤降低，TEER值回升，FD4透过率降低，ZO-1和CLDN-1蛋白表达升高（P<0.05）。结论 F. nucleatum感染可能通过铁死亡途径促进DSS诱导的体外肠道上皮屏障破坏。

关键词

具核梭杆菌 / 肠道上皮屏障 / 铁死亡 / Caco-2细胞 / 牙周炎 / 溃疡性结肠炎

基金资助

国家自然科学基金（81970944）; 四川省自然科学基金（2023-NSFSC0553）; 国家自然科学基金青年项目（82301089）