微小RNA200a/141-信号转导和转录激活因子4轴在口腔鳞状细胞癌进展中的作用研究

Role of mircoRNA200a/141-signal transduction and transcriptional activator 4 axis in the progression of oral squamous cell carcinoma

摘要

目的 基于公共数据库探索微小RNA（miRNA）200a/141、信号转导和转录激活因子4（STAT4）在口腔鳞状细胞癌（OSCC）中的表达及临床意义并构建预后模型，探讨其作为潜在治疗靶点的可行性。通过体外实验验证仿生明胶外泌体颗粒递送miRNA200a/141进而调节STAT4，评估在OSCC的细胞和分子水平上的核酸保护能力及抗癌作用。 方法 通过癌症基因组图谱数据库下载OSCC相关miRNA及信使RNA表达测序数据，使用R语言进行数据分析，评估miRNA200a/141与STAT4的表达水平和临床相关性。制备负载miRNA200a/141的仿生明胶外泌体纳米颗粒（GNP-EXO-miRNA200a/141），进行Transwell迁移、细胞划痕和四甲基偶氮唑蓝实验，评估纳米颗粒对SCC25细胞的作用，并通过定量聚合酶链式反应和蛋白质免疫印迹法检测其对SCC25细胞中STAT4表达的影响。 结果 miRNA200a/141在OSCC组织中的表达水平显著降低，而其靶标STAT4的表达水平升高，两者呈负相关。制备的GNP-EXO-miRNA200a/141纳米颗粒具有良好的粒径分布和稳定性。在细胞实验中，GNP-EXO-miRNA200a/141显著抑制了SCC25细胞的增殖和迁移，并显著下调了STAT4的表达。 结论 miRNA200a/141通过调节STAT4在OSCC中发挥重要作用，其有望成为OSCC的诊断、治疗和预后的潜在的分子标志物和治疗靶点。

Abstract

Objective　This study aimed to explore the expression and clinical significance of mircoRNA (miRNA) 200a/141 and signal transducer and activator of transcription 4 (STAT4) in oral squamous cell carcinoma (OSCC) and construct a prognostic model to explore its feasibility as a potential therapeutic target. In vitro experiments verified that bionic gelatin exosome particles delivered mi-RNA200a/141 to regulate STAT4. This study also aimed to evaluate the protective capacity and anticancer effects of nucleic acids at the cellular and molecular levels of OSCC. Methods　OSCC-related miRNA-sequencing and messenger RNA-sequencing data were downloaded from The Cancer Genome Atlas database. Data analysis was performed using R language to assess the expression levels and clinical correlation of miRNA200a/141 with STAT4. Biomimetic gelatin exosome nanoparticles (GNP-EXO-mi-RNA200a/141) loaded with miRNA were prepared, and Transwell migration assay, cell scratch assay, and methyl thiazolyl tetrazolium assay were performed to evaluate the effect of nanoparticles on SCC25 cells. The effects of the nanoparticles on STAT4 expression in SCC25 cells were examined using quantitative polymerase chain reaction and Western blot. Results　The expression of miRNA200a/141 was significantly reduced in OSCC tissues, whereas that of its target STAT 4 increased, which was inversely correlated. The prepared GNP-EXO-miRNA200a/141 nanoparticles showed good size distribution and stability. In cell experiments, GNP-EXO-miRNA200a/141 significantly inhibited the proliferation and migration of SCC25 cells and significantly downregulated STAT4 expression. Conclusion　miRNA200a/141 plays an important role in OSCC by regulating STAT4, and it is expected to be a potential molecular marker and therapeutic target for the diagnosis, treatment, and prognosis of OSCC.

Graphical abstract

关键词

口腔鳞状细胞癌 / 微小RNA 200a/141 / 信号转导和转录激活因子4 / 外泌体 / 明胶纳米颗粒

Key words

oral squamous cell carcinoma / mircoRNA200a/141 / signal transducer and activator of transcription 4 / exosomes / gelatin nanoparticles

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是一种高侵袭性的肿瘤，占所有口腔恶性肿瘤的90%。在早期转移的情况下，患者的生存率仅为40%~50%^[1]，这一现象主要与晚期常发生的淋巴结转移相关^[2]。TNM分期系统基于对原发肿瘤大小、局部淋巴结受累和远处转移的评估，有助于OSCC的风险分层和区分早期与晚期OSCC。目前，手术仍是OSCC的首选治疗方法，对于晚期病例，可选择辅助治疗，如放疗、化疗、免疫和靶向治疗。微小RNA（mirco RNA，mi-RNA）在癌症中的表达分析不仅有助于鉴定具有诊断、预后和预测价值的miRNA，还能揭示与癌症发生、进展相关的miRNA的病因学作用^[3]。miRNA200家族在多种癌症中表现为下调，并在肿瘤转移和血管生成中发挥重要作用^[4]。其中，mi-RNA200a在食管鳞状细胞癌和胃癌中下调，参与上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和侵袭转移过程^[5]。miRNA141在食管鳞状细胞癌中呈低表达，而在内皮细胞中发挥抗血管生成作用^[6-7]。基因组分析表明，食管鳞状细胞癌和头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）具有共同的致病机制^[8]。除了miRNA200a/141，其他一些关键miRNA如miRNA21、miRNA155、miRNA146a等也在HNSCC中表现出异常表达，并在癌症的发生和进展中发挥重要作用^[9-10]。这些miRNA的功能和机制也值得进一步研究和探讨，以全面了解OSCC的分子机制并开发新的治疗策略。

癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库提供了全面的癌症基因组图谱，有助于癌症的诊断、治疗和预防^[11]。研究^[12-13]发现，信号转导和转录激活因子4（signal transducer and activator of transcription 4，STAT4）是mi-RNA200a和miRNA141的潜在靶标，这两种miRNA通过靶向STAT4发挥抑癌作用，协同抑制上皮细胞钙黏蛋白和波形蛋白的表达，调节癌细胞增殖和迁移。miRNA疗法作为一种特异性、高效且安全的癌症治疗方法，其上调可增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性^[14]。外泌体（exosome，EXO）是一种有效的miRNA递送工具，具有生物相容性和稳定性。EXO在递送miRNA200a可有效抑制EMT介导的癌细胞转移^[15]。

本研究通过生物信息学分析OSCC中的mi-RNA200a/141表达数据，并与患者临床信息进行关联分析，构建预后模型，以预测OSCC患者的预后情况。通过制备负载miRNA的仿生明胶纳米颗粒，评估其在细胞和分子水平上的核酸保护能力和抗癌作用。开发安全有效的miRNA载体对于癌症的治疗具有重要意义。这种结合miRNA的精准性和纳米颗粒的传递效果，提供了一种高效特异性的肿瘤治疗策略。

1　 材料和方法

1.1　 数据下载与分析

1.1.1　 数据下载

从TCGA数据库（http://www.cancer.gov/ccg/）下载HNSCC中口腔相关部位（包括口底、舌、牙龈、腭、唇、口腔其他未指明部位）的样本信息和临床数据，排除非口腔相关部位（如喉、口咽、扁桃体）的样本。下载miRNA测序（miRNA sequencing，miRNA-seq）及信使RNA测序（messenger RNA sequencing，mRNA-seq）相关数据，截止日期为2023年8月6日。使用R 4.3.1进行数据整理，导入后清洗并删除缺失值和异常值。

1.1.2　 分析miRNA200a/141和STAT4在OSCC中表达的差异

整理miRNA-seq及mRNA-seq表达矩阵，提取数据，构建分组矩阵，储存为肿瘤（tumor）和正常（normal）矩阵。安装基于负二项分布的差异基因表达分析 2版（differential gene expression analysis based on the negative binomial distribution version 2，DESeq2）包进行差异基因表达分析，筛选出miRNA200a/141和STAT4在肿瘤与癌旁组织中的表达。通过威尔科克森秩和检验（Wilcoxon）比较OSCC样本和癌旁样本的中位数差异，应用ggplot2包进行可视化。

1.1.3　 miRNA200a/141与STAT4的相关性分析

使用斯皮尔曼等级相关系数（Spearman）分析miRNA-141与STAT4、miRNA-200a与STAT4的相关性，结果用相关系数R值表示，并应用ggplot2和ggExtra包进行可视化。

1.1.4　 构建miRNA200a/141和STAT4在OSCC中的预后模型

整理患者临床数据，使用survival包进行比例风险假设检验和生存回归分析。将mi-RNA200a/141和STAT4按中位数分为高表达组和低表达组，分析其与患者预后的相关性。使用survminer包计算总生存期（overall survival，OS），建立预后模型。进行miRNA200a/141和STAT4的单因素和多因素Cox回归分析。

1.2　 体外实验

1.2.1　 主要试剂与仪器

人口腔鳞状细胞癌SCC25细胞系购自美国典型培养物保藏中心，间充质干细胞购自北京友康生物。ZS90纳米颗粒尺寸和zeta电位分析仪（马尔文仪器有限公司，英国）；荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）扩增仪（ABI公司，美国）；TRNzol总RNA提取试剂[天根生化科技（北京）有限公司，中国]；胎牛血清、二甲基亚砜（BI公司，以色列）；达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）（Giboco公司，美国）；Trizol提取试剂盒、Lipofectamine^TM RNAiMAX转染试剂和STAT4抗体（赛默飞世尔科技公司，美国）；胰蛋白酶（北京索莱宝生物技术有限公司，中国）；细胞活力检测的四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）试剂（Sigma公司，美国）；引物（Promega公司，美国）。

1.2.2　 SCC25细胞的体外培养

将冻存的SCC25细胞解冻，用70%乙醇消毒安瓿，1 000 r/min离心5 min去除二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），弃上清。将SCC25细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基，37 ℃、5%CO₂培养箱中培养过夜。

1.2.3　 仿生明胶EXO颗粒的制备及性能检测

制备明胶纳米颗粒（gelatin nanoparticles，GNP）：将1.25 g B型明胶溶于25 mL蒸馏水中，加热溶解后加入25 mL丙酮。沉淀物重新溶于25 mL水中，调节pH至2.5，逐滴添加40 mL丙酮进行脱溶，搅拌10 min，加入8%戊二醛交联30 min，离心后加热至40 ℃蒸发丙酮，得到阳离子GNP。

负载miR-200a的GNP（GNP-miR-200a）：按制造商方案制备Lipofectamine^TM RNAiMAX复合物，将miRNA阳离子脂质体加入明胶溶液并稀释，随后将GNP分散于无水乙醇中，加入4-甲酰苯硼酸反应过夜，离心后分散沉淀物形成GNP-miR-200a。

负载EXO的GNP（GNP-EXO）：培养间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）至80%汇合，收集细胞培养上清液，超速离心（100 000×g，2 h）去除沉淀物，提取EXO；GNP与EXO共孵育，使EXO表面吸附或包裹GNP，超速离心进一步纯化GNP-EXO，重悬于磷酸盐缓冲盐水（phosphate buffered saline，PBS）中。

MSC转染miRNA-141：培养MSC至80%汇合，按制造商方案制备Lipofectamine^TM RNAiMAX和miRNA-141复合物，加入12孔细胞培养板中培养24 h。

负载miRNA200a/141的仿生明胶EXO颗粒（GNP-EXO-miRNA200a/141）：将miRNA-141复合物与GNP-miRNA-200a混合培养，收集细胞培养上清，超速离心去除沉淀物，提取EXO，重悬于PBS中并过滤去除杂质，冻存于-80 ℃（图1）。

1.2.4　 仿生明胶EXO颗粒的性能检测

通过动态光散射和透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）观察GNP、GNP-EXO、GNP-EXO-miRNA200a/141纳米颗粒的粒径和Zeta电位的表征。

蛋白质印迹检测EXO标志蛋白CD63、CD9的表达：用PBS洗涤细胞，加入放射免疫沉淀缓冲液（radio immunoprecipitation assay buffer，RIPA）裂解液，离心回收蛋白质。用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法测定蛋白质含量，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），蛋白转移后封闭，孵育一抗和二抗，显色并用Image J软件分析图像。

检测GNP-EXO-miRNA200a/141颗粒的稳定性：分别将miRNA200a/141（未加载体）、GNP-EXO-miRNA200a/141与10 µg RNase A混合孵育，再与1%的十二烷基硫酸钠溶液混合后，引入1.2%琼脂糖凝胶样品孔中，电泳30 min，分析未降解的miRNA条带亮度，评估miRNA载体对抗miRNA降解的保护功效。

1.2.5　 检测GNP-EXO-miRNA200a/141颗粒对SCC25细胞的抑制作用

用胰酶消化SCC25细胞，加入完全培养液，计数细胞数，接种于96孔板。使用阳离子脂质体将样品转染至细胞内，设置GNP-EXO（对照）、miRNA200a/141、GNP-EXO-miRNA200a/141组，每组设3个孔。细胞培养24、48和72 h，进行MTT实验，测量吸光度。

1.2.6　 蛋白质印迹检测SCC25细胞中EXO标志蛋白CD63、CD9表达及STAT4蛋白水平

用PBS洗涤细胞，加入放射免疫沉淀缓冲液（radio immunoprecipitation assay buffer，RIPA）裂解液，离心回收蛋白质。用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法测定蛋白质含量，进行SDS-PAGE，蛋白转移后封闭，孵育一抗和二抗，显色并用Image J软件分析图像。

1.2.7　 检测GNP-EXO-miRNA200a/141颗粒对SCC25细胞增殖和迁移的影响

Transwell实验检测细胞取对数生长的细胞，调整细胞密度，制备细胞悬液。准备Transwell上室和下室，分别加入细胞悬液和细胞外囊泡，培养48 h，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，计数迁移细胞数。

将对数生长期的SCC25细胞，胰蛋白酶消化成单细胞悬液，接种于6孔培养板，细胞培养37 ℃、5%CO₂培养箱中培养24 h，待细胞生长至80%时，每孔时分别于不同孔注入GNP-EXO、miRNA200a/141、GNP-EXO-miRNA200a/141，分别在划痕后的 0、24、48 h 时，在倒置显微镜下拍照并记录每孔划痕直径。

1.2.8　 使用qRT-PCR检测SCC25细胞中miRNA的表达水平

用Trizol法提取总RNA，加入Trizol试剂，混匀，加入氯仿，离心收集上清，加入异丙醇沉淀RNA，洗涤RNA，用二乙基焦磷酸酯（diethylpyrocarbonate，DEPC）水重溶RNA。使用miRNA逆转录试剂盒将miRNA逆转录为互补DNA（complementary DNA，cDNA），采用SYBR Green Ⅰ法实时荧光定量检测miRNA。

qRT-PCR反应流程：预变性94 ℃ 5 min，变性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，30个循环。用2^-(ΔΔCt)法对实验结果进行分析，选择甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作为内参。miRNA引物基于基因组数据库设计，由上海吉玛公司合成，详见表1。

1.3　 统计方法

采用R 4.3.1和IBM SPSS Statistics 23.0进行数据处理和统计分析。使用Shapiro-Wilk方法检验数据正态分布，符合正态分布的数据用均数±标准差表示。

两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，两组间进一步比较采用LSD t检验，检验水准α=0.05。

2　 结果

2.1　 miRNA200a/141与STAT4在OSCC中的关联分析结果

2.1.1　 纳入样本临床数据分析结果

使用TCGA数据库共下载345例样本数据，包括313例OSCC组织样本和32例癌旁组织样本的miRNA-seq和mRNA-seq数据及临床数据。清洗数据后，共纳入259例OSCC组织样本和32例癌旁组织样本，其中年龄≥50岁患者共215例（83%），年龄<50岁患者共44例（17%），男性患者共176例（68%），女性患者83例（52%）。

2.1.2　 miRNA200a/141在OSCC临床队列中的表达及与STAT4的相关性分析结果

miRNA和信使RNA的差异表达分析结果显示：红色代表OSCC组织，蓝色代表癌旁组织，OSCC组织中mi-RNA200a/141呈低表达，STAT4呈高表达，P值均小于0.05，差异有统计学意义（图2）。相关性分析结果显示，miRNA-200a与STAT4的相关系数R值为-0.267（P<0.001），miRNA141与STAT4的相关系数R值为-0.283（P<0.001），均呈负相关（图3）。

2.1.3　 miRNA-200a/141与STAT4在OSCC中的表达及预后分析结果

miRNA-200a/141与STAT4在OSCC中的表达分析结果表明：在miRNA-200a/141样本中，低表达组的死亡风险要高于高表达组（P<0.01）（图4A、B）；在STAT4样本中，高表达组的死亡风险要高于低表达组（P<0.000 1）（图4C）。单因素回归分析发现，患者年龄和性别的差异无统计学意义（P>0.05），而Ⅲ期和Ⅳ期[危险比（hazard ratio，HR）=1.776，95%CI：1.086~2.905，P=0.022]，T3~T4期（HR=2.269，95%CI：1.464~3.517，P<0.001），N2~N3期（HR=1.847，95%CI：1.206~2.829，P=0.005），miRNA-200a低表达组（HR=1.916，95%CI：1.193~3.076，P=0.007），miRNA-141低表达组（HR=2.298，95%CI：1.377~3.835，P=0.001），STAT4高表达组（HR=3.016，95%CI：2.017~4.511，P<0.001）是影响OSCC患者预后的危险因素。多因素回归分析发现，T3和T4（HR=1.863，95%CI：1.201~2.891，P=0.006），miRNA-141低表达组（HR=2.077，95%CI：1.240~3.478，P=0.005），STAT4高表达组（HR=2.715，95%CI：1.809~4.075，P<0.001）是影响OSCC患者预后的独立危险因素，具体见表2。

2.2　 仿生明胶EXO颗粒的理化性质

由TEM图像可见，GNP-EXO和GNP-EXO-miRNA 200a/141纳米颗粒呈圆形结构（图5A、B）；GNP颗粒平均粒径为（109.1±12.1）nm，GNP-EXO颗粒则增加到（123.1±12.3）nm（图5C，表3），GNP-EXO-miRNA200a/141颗粒粒径为80~160 nm，平均分散指数（polydispersity index，PDI）为0.214±0.030（图5D，表3）。GNP、GNP-EXO、GNP-EXO-miRNA200a/141颗粒的表面电位分别为（24.53±0.70）（-11.00±1.20）（-10.20±0.70）mV（表3），由图5E可见，从MSC中收获的EXO成功包被了GNP和GNP-miRNA200a/141的表面。

综上，GNP-EXO、GNP-EXO-miRNA200a/141颗粒粒径，Zeta电位和EXO标记物CD63和CD9的表达均成功验证了颗粒的制备成功。

琼脂糖凝胶电泳图（图5F）显示，与RNase A孵育2 h后，裸露miRNA的荧光强度迅速下降。与裸露miRNA相比，GNP-EXO-miRNA200a/141在含RNase A的溶液中培养4 h后表现出显著的抗降解能力，说明制备的GNP-EXO-miRNA200a/141颗粒稳定性良好。

2.3　 GNP-EXO-miRNA 200a/141颗粒对SCC25细胞的作用

2.3.1　 细胞活力检测

miRNA200a/141颗粒和GNP-EXO-miRNA 200a/141颗粒对SCC25细胞生长的抑制具有时间依赖性，GNP-EXO-miRNA200a/141颗粒对细胞生长的抑制作用更显著（图6）。

2.3.2　 Transwell实验结果

miRNA200a/141和GNP-EXO-miRNA200a/141均能显著抑制SCC25细胞的迁移，GNP-EXO-miRNA200a/141颗粒效果更佳（图7）。

划痕实验结果显示：与GNP-EXO相比，48 h后观察到GNP-EXO-miRNA200a/141明显降低了SCC25细胞的迁移（P<0.01）（图8）。

2.3.3　 GNP-EXO-miRNA200a/141颗粒降低SCC25细胞中STAT4的表达

qRT-PCR和蛋白质印迹结果显示：miRNA200a/141和GNP-EXO-miRNA200a/141均能显著降低SCC25细胞中STAT4的表达，GNP-EXO-miRNA200a/141颗粒效果更优（图9）。

3　 讨论

OSCC是最常见的口腔恶性肿瘤。目前手术、化学疗法和放射疗法是主要的治疗手段，但对于转移或晚期OSCC患者，现有治疗方法的效果仍然有限^[2,16]。基因组学研究显示，OSCC的可操作靶标有限，已获批的靶向疗法也非常局限。近年来，生物信息学方法在癌症研究中得到了广泛应用，可以识别和筛选OSCC的基因表达模式，为现有药物的重新定位提供了低成本和高效率的策略^[17]。miRNA在癌症中的作用已被广泛研究，作为癌症标志物，它们在诊断、预后和治疗中具有巨大潜力^[18]。miRNA200家族成员，如miRNA-200a和miRNA-141，在多种癌症中被认为是潜在的生物标志物和预后预测因子^[19]。本研究通过TCGA数据库分析，发现miRNA200a/141在OSCC组织中的表达水平显著降低，而STAT4的表达水平显著升高，二者呈显著负相关。

这一结果证实，miRNA200a/141与肿瘤中的特定靶标之间存在负相关表达关系，尤其是STAT4在miRNA200a/141介导的增殖加速和应激效应减少中起关键作用。研究^[20]表明，miRNA-200a和miRNA-141通过调节STAT4，抑制EMT过程，从而调控癌细胞的增殖和迁移。此外，本研究发现，miRNA200a/141低表达组的患者死亡风险显著高于高表达组，而STAT4高表达组的患者死亡风险显著高于低表达组。

这些结果表明，miRNA200a/141在OSCC中的低表达和STAT4的高表达是影响OSCC患者预后的重要因素。

目前，纳米技术在靶向给药系统的探索中发挥着重要作用，但通过纳米给药系统将药物递送到肿瘤组织中仍存在许多困难，例如无机纳米材料引起的免疫反应、肿瘤部位蓄积作用差、药物被溶酶体困住而无法发挥疗效等^[21]。明胶是一种天然的蛋白质水解产物，无毒，无免疫原性，具有良好的生物相容性。它还可以修饰肽链上的羧基和氨基改变其理化性质^[22]。特别值得注意的是，由于明胶纳米颗粒能够被肿瘤组织中富集的金属蛋白酶降解，因此具有实现药物释放的潜力^[23]。本研究通过二次脱溶剂法和差速离心法制备了负载miRNA的仿生纳米载体系统，成功制备了GNP-EXO-miRNA200a/141纳米颗粒，这些纳米颗粒的粒径分布在80~160 nm，具有良好的分布均匀性和稳定性。EXO是真核细胞内形成的具有双膜结构的胞外囊泡，直径在40~160 nm^[24]。它们不仅作为稳定可靠的miRNA来源，为体液中被封装的mi-RNA提供保护，使其在非生理条件下不被降解，还通过运输包括包括miRNA在内的多种生物活性成分，在细胞通讯中起着至关重要的作用^[25]。肿瘤衍生EXO通过局部微环境重塑、远距离转移、血管生成和免疫抑制等动态变化促进癌症生长和侵袭，其中的miRNA是最有效的EXO载物，可用于追踪EXO、早期检测癌症细胞活性变化、预后预测以及调控缺氧诱导的肿瘤进展和癌细胞耐药性^[26]。有研究^[27]表明，EXO可有效地将miRNA-200a递送，显著促进胃癌细胞中miRNA-200a的表达水平，并且相应减少ZEB1、vimentin、Snail1和β-catenin的表达，同时增加E-cadherin以抑制肿瘤细胞的转移。通过靶向具有致癌特性的EXO-miRNA预防转移，有助于HNSCC的治疗^[28]。

蛋白CD63和CD9是存在于细胞外囊泡群体中的标记物，在过去20年中已被用作EXO标记物^[29]，本研究证实，CD63和CD9在GNP-EXO和GNP-EXO-miRNA200a/141颗粒中表达，表明MSC细胞中收获的EXO成功包被GNP和GNP-EXO-miRNA200a/141表面，通过观察表面电位和典型标记物的存在，确认了提取的细胞外囊泡为EXO。进一步的细胞实验中发现，GNP-EXO-miRNA200a/141颗粒对SCC25细胞迁移具有显著抑制作用，并表现出时间依赖性。有研究^[15]表明，miR-200a和miR-141的下游蛋白STAT4在恶性肿瘤中常发生失调，两者在EMT过程中协同抑制E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白的表达，并通过靶向STAT4调控OSCC细胞的增殖、迁移和侵袭。在HNSCC患者外周血中，免疫调节剂干扰素a2b可诱导STAT4的激活^[30]。本研究评估了miRNA200a/141组和GNP-EXO-mi-RNA200a/141颗粒对SCC25细胞中STAT4表达的影响，采用qRT-PCR和蛋白印迹分析来量化STAT4表达水平，比较各组之间的差异。结果显示，与miRNA200a/141组相比，GNP-EXO-miRNA 200a/141组中STAT4显著下调，这一结果与Transwell测定的观察结果一致。

本研究成功地揭示了miRNA200a/141在OSCC中的重要调控作用，特别是其通过调节STAT4抑制肿瘤增殖和迁移的机制。通过TCGA数据库的生物信息学分析，本研究发现miRNA200a/141在OSCC中的表达显著降低，而STAT4表达显著升高，二者呈负相关。基于这一发现，笔者进一步制备了负载miRNA的仿生明胶EXO纳米颗粒GNP-EXO-miRNA200a/141，并在细胞水平上验证了其对SCC25细胞增殖和迁移的显著抑制作用。GNP-EXO-miRNA200a/141纳米颗粒展现出优良的核酸保护能力和生物活性，在体外实验中有效下调了STAT4的表达水平，抑制了OSCC细胞的迁移性。本研究表明，miRNA200a/141-STAT4轴在OSCC的发展和发展中起关键作用，利用仿生纳米载体递送miRNA200a/141不仅增强了miRNA的稳定性，还显著提高了其抑制肿瘤的效果。这一创新性的纳米递送系统为OSCC的精准治疗提供了新的策略和方向，具有潜在的临床应用价值。未来的研究应进一步在不同细胞系及动物体内实验中验证这些结果，以期为OSCC患者提供更有效的治疗手段，提高患者的生存率和生活质量。

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