GTKO猪的生产及猪-恒河猴肾脏异种移植

摘要

目的 探讨α-1,3半乳糖基转移酶（GGTA1）基因敲除（GTKO）滇南小型猪的构建及猪到恒河猴的肾脏异种移植，评估GTKO猪的有效性。方法 利用CRISPR/Cas9基因修饰系统和体细胞克隆技术构建GTKO滇南小型猪，通过聚合酶链反应、Sanger测序、免疫荧光染色等验证GTKO猪的表型。流式细胞术检测抗原抗体（IgM）结合与补体依赖细胞毒性，并进行GTKO猪到恒河猴的肾脏异种移植，监测受体猴体液免疫、细胞免疫、凝血及生理指标，利用超声检查、苏木素-伊红染色、免疫组织化学染色和免疫荧光染色等分析移植肾功能和病理学改变。结果 靶向滇南小型猪GGTA1基因第4外显子设计单向导RNA（sgRNA），将pGL3-GGTA1-sgRNA1-GFP载体转染到滇南小型猪胎儿成纤维细胞中，经嘌呤霉素筛选后，获得的C59#和C89#两个细胞克隆点均鉴定为GGTA1基因敲除克隆点，经扩大培养形成细胞系后用作供体细胞进行体细胞克隆，并将重构胚胎移植至三元杂代孕母猪输卵管中，获得13头胎儿猪，其中F04和F11胎儿的GGTA1基因发生双等位基因突变，且F04核型正常，利用此GTKO胎儿猪进行重克隆，并将重构胚胎移植至三元杂代孕母猪输卵管中，共获得7头存活仔猪，其均不表达α-Gal抗原表位。20#恒河猴血清IgM与GTKO猪PBMC结合数量减少，且GTKO猪PBMC在补体依赖细胞毒性实验中的存活率高于野生型猪。获取GTKO猪肾并进行灌注直至完全变白，切除受体猴左肾后进行猪肾异位移植，血管吻合完成后开放血流，猪肾迅速变为粉红色，未发生超急性排斥反应（HAR）,6 min后输尿管出现尿液，表明肾移植术成功，再切除受体右肾。移植术后7 d移植肾血流供应良好，受体猴血清肌酐水平稳定，血清钾和胱抑素C水平得到有效控制，但在移植术后10 d均升高。移植术后7 d受体猴体内白细胞、淋巴细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞水平均升高，血小板计数和纤维蛋白原水平均降低，而活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间和凝血酶原时间均较为稳定，之后呈上升趋势。受体猴存活10 d，尸检发现移植肾充血、肿胀和坏死，肾组织中少量IgG沉积，大量IgM、补体C3c和C4d沉积，CD68⁺巨噬细胞浸润。结论 GTKO滇南小型猪肾脏可在恒河猴体内维持一定时间的正常肾功能，并有效克服HAR，证实GTKO猪用于异种移植有效。

关键词

GGTA1基因敲除猪 / 恒河猴 / 肾脏异种移植 / 基因修饰 / 超急性排斥反应 / 免疫抑制 / 外周血单个核细胞 / 体细胞核移植