DA大鼠骨髓来源PD-L1^hitol-DC构建及其免疫学功能鉴定

摘要

目的 构建DA大鼠骨髓来源程序性细胞死亡蛋白配体1（PD-LI）^hi耐受性树突状细胞（tol-DC）并鉴定其免疫学功能。方法提取DA大鼠骨髓细胞，联合应用重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和重组小鼠白细胞介素（IL）-4，体外培养6 d诱导骨髓细胞分化为未成熟树突状细胞（imDC）；应用脂多糖刺激细胞成熟，继续培养2d收集成熟树突状细胞（mDC）；加入PD-L1慢病毒载体病毒原液或同等剂量慢病毒病毒原液，培养2 d后收集PD-L1^hitol-DC和Lv-imDC。应用倒置相差显微镜及透射电镜观察PD-L1^hitol-DC形态；实时荧光定量逆转录聚合酶链反应、蛋白质印迹法及流式细胞术检测细胞表面特异性标志物表达水平。将imDC、mDC、Lv-imDC及PD-L1^hitol-DC分别与Lewis大鼠脾脏来源CD8⁺T细胞共培养，酶联免疫吸附试验检测各组上清液炎症因子水平，流式细胞术分析各组T细胞凋亡及调节性T细胞（Treg）分化情况。结果经PD-L1基因修饰构建的PD-L1^hitol-DC形态符合tol-DC特征，表面CD80、CD86、主要组织相容性复合体（MHC）表达水平较低。与CD8⁺T细胞混合培养后，PD-L1^hitol-DC组上清液IL-10、转化生长因子（TGF）-β1水平较高，肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-17A水平较低，T细胞凋亡及Treg分化增多。结论通过慢病毒载体过表达PD-L1可成功诱导构建DA大鼠骨髓来源PD-L1^hitol-DC，促进抑炎因子分泌及T细胞凋亡，诱导Treg分化，抑制同种异体CD8⁺T细胞免疫反应，这为下一步器官移植免疫耐受研究提供了实验依据。

关键词

树突状细胞 / 器官移植 / 免疫耐受 / 免疫抑制 / 程序性细胞死亡蛋白配体1 / T细胞 / 调节性T细胞 / 炎症因子

基金资助

宁夏自然科学基金（2021AAC03308、2024AAC03450）; 宁夏回族自治区人民医院科技创新人才项目（院党发[2023]72号）;宁夏回族自治区人民医院国家自然科学基金预实验项目（2024GZRYSY0015）