下调GSK3β通过抑制ITPR1-GRP75-VDAC1复合体功能减轻衰老肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤

摘要

目的 探讨糖原合成酶激酶3β(GSK3β)对衰老小鼠原代肾小管上皮细胞（RTEC）缺氧/复氧（H/R）损伤的影响及其调控机制。方法 将RTEC分成为Young组即正常生长的年轻RTEC、Old组即使用Etoposide诱导的衰老RTEC、Old+Ad-shNC+H/R组即使用Etoposide诱导衰老再转染腺病毒阴性对照（AdshNC）后进行H/R处理，Old+Ad-shGSK3β+H/R组即使用Etoposide诱导衰老后再转染靶向沉默GSK3β的短发夹RNA腺病毒（Ad-shGSK3β）后进行H/R处理。采用流式细胞术检测各组细胞凋亡水平和线粒体活性氧水平，采用免疫荧光染色法检测各组钙离子水平，采用蛋白质印迹法检测各组GSK3β、线粒体相关的内质网膜（MAM）相关蛋白肌醇1,4,5-三磷酸受体1(ITPR1)、电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)、葡萄糖调节蛋白75(GRP75)表达及磷酸化水平，采用免疫共沉淀分析GSK3β与MAM相关蛋白的相互作用。结果 与Young组比较，Old组细胞凋亡水平、线粒体活性氧水平及线粒体钙离子水平均较高；与Old组比较，Old+AdshNC+H/R组细胞凋亡水平、线粒体活性氧水平及线粒体钙离子水平均较高；与Old+Ad-shNC+H/R组比较，Old+Ad-shGSK3β+H/R组细胞凋亡水平、线粒体活性氧水平及线粒体钙离子水平均较低，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与Young组比较，Old组ITPR1、GRP75和GSK3β总蛋白表达增多，ITPR1和GRP75磷酸化水平升高，而VDAC1总蛋白和磷酸化水平均下降；与Old组比较，Old+Ad-shNC+H/R组GSK3β蛋白表达不变，ITPR1和GRP75总蛋白和磷酸化水平升高，VDAC1总蛋白表达不变，磷酸化水平增高；与Old+AdshNC+H/R组比较，Old+Ad-shGSK3β+H/R组GSK3β蛋白表达减少，ITPR1、GRP75和VDAC1总蛋白表达不变，磷酸化水平均下降。免疫共沉淀结果显示，GSK3β能够与ITPR1、GRP75和VDAC1蛋白发生相互作用。结论GSK3β在衰老RTEC中表达升高，抑制GSK3β表达能够降低ITPR1-GRP75-VDAC1复合体磷酸化水平，限制线粒体钙离子超负荷，保护线粒体功能，减少再灌注时细胞损伤。

关键词

糖原合成酶激酶3β / 肾移植 / 中老年供者 / 缺血-再灌注损伤 / 线粒体损伤 / 衰老 / 线粒体相关的内质网膜 / 钙超载 / 凋亡

基金资助

国家自然科学基金（82170772、82370759）; 湖北陈孝平科技发展基金会青年科学专项基金（CXPJJH122001-2210）