高选择性α_2A-AR激动剂药理活性评价及机制研究

摘要

目的：α_2A-AR是介导镇静作用的α₂-AR亚型，以右美托咪定（DMED）为代表的镇静催眠药没有亚型选择性，为了减少药物由于选择性带来的副作用，提高药物对受体亚型选择性，我们使用构象约束法设计并筛选一系列α_2A-AR激动剂，从中发现以咪唑-4-色满为骨架的化合物B9对α_2A-AR选择性优于DMED，镇静效果与DMED相当。LXC2001是化合物B9的衍生物，本研究明确其药理活性及作用机制。方法：采用PKA重分布实验和高内涵细胞筛选系统检测LXC2001对α_2A-AR、α_2C-AR、α_2B-AR、α_1A-AR的激活程度；通过LXC2001与α_2A-AR分子对接分析化合物LXC2001与α2A-AR相互作用的氨基酸位点，对α_2A-AR点突变验证受体与LXC2001作用的关键氨基酸位点；以小鼠自发活动模型和小鼠翻正反射消失模型，评价LXC2001的镇静作用；采用醋酸扭体实验评价LXC2001的镇痛作用；用致死性毒性模型观察化合物对C57小鼠的毒性作用；对DMED、LXC2001镇静和毒性作用后不同组织进行转录组学分析，比较两者对转录组学影响，阐明化合物的作用机制。结果：PKA重分布实验检测LXC2001对α_2A-AR、α_2C-AR、α_2B-AR、α_1A-AR的激活程度，发现LXC2001对α_2A-AR具有高度选择性, LXC2001对α_2A/α_2B、α_2A/α_2C、α_2A/α_1A选择系数分别为84.80、29.40和15.00，明显高于DMED对α_2A/α_2B、α_2A/α_2C、α_2A/α_1A选择系数0.80、2.30、5.50选择性；LXC2001与α_2A-AR分子对接，发现α_2A-AR的Asp128（D113）、Phe427（F412）、Ser215（S200）和Tyr409（Y394）与LXC2001有结合作用；α_2A-AR点突变后，发现LXC2001作用于α_2A-AR-Y394A、α_2A-AR-F412A突变体后，与野生型相比，胞内cAMP明显上调，提示这两个位点是LXC2001与α_2A-AR作用的重要位点；在自发活动为模型上，LXC2001、DMED(1～75μg·kg^-1)剂量依赖性抑制小鼠自发活动的运动总距离、运动时长，LXC2001抑制能力较DMED略强；小鼠翻正反射消失模型上，同等剂量下，LXC2001比DMED对小鼠翻正反射消失的诱导时间更短，制动时间更长，二者在诱导小鼠翻正反射消失率水平基本相当；预先给予DMED、LXC2001(0.60, 1.00, 3.00,6.00, 10.00, 30.00, 60.00μg·kg^-1, i.p.)后，小鼠腹腔注射0.6%醋酸，DMED,LXC2001剂量依赖性抑制小鼠醋酸扭体次数，LXC2001和DMED的ED50分别为0.171μg·kg^-1和3.286μg·kg^-1,LXC2001的镇痛作用度为DMED的近20倍；DMED、LXC2001(0.562, 1.00, 1.40, 2.00, 5.00, 8.50 mg·kg^-1, i.p.)给药C57小鼠后，观察化合物14天毒性作用，DMED的LD50值为1.837 mg·kg^-1,LXC2001的LD50值为4.299 mg·kg^-1，说明LXC2001的毒性作用弱于DMED；对DMED、LXC2001镇静和毒性作用后不同组织进行转录组学分析，比较两者对转录组学影响，发现LXC2001, DMED(0.20, 8.00 mg·kg^-1)产生差异基因大多参与调节炎症、免疫通路、细胞凋亡、钙信号通路、神经生成以及中枢神经系统神经元分化等生物学过程，相关机制还需要进一步探索。结论：LXC2001是高效低毒的高选择性α2A-AR激动剂

关键词

α_2A-AR激动剂 / DMED / LXC2001 / 镇静镇痛 / 转录组学