缺血诱导的PPARα缺失加剧神经元泛凋亡

摘要

目的：研究过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferators-activated receptor α,PPARα）对缺血性脑卒中后神经元泛凋亡的影响。方法：利用多重免疫荧光技术表征氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）诱导后小鼠原代神经元泛凋亡体的聚集；通过Western blot检测野生型（WT）小鼠原代神经元和PPARα全身性敲除（KO）小鼠原代神经元经OGD/R诱导后泛凋亡相关蛋白（p-MLKL、Caspase-1等）的表达；利用CCK8法检测GW6471对OGD/R诱导后N2a细胞系细胞活力的影响，采用CCK8法评估PPARα敲减后N2a细胞系(经OGD/R诱导后细胞活力的变化；利用多重免疫荧光技术等方法检测OGD/R诱导后N2aVector和N2a^PPARα-/-细胞系泛凋亡体及相关蛋白的表达；提取WT或KO小鼠原代神经元细胞，通过感染慢病毒（lentivirus,LV）的方法实现外源性PPARα表达，并对活细胞（Annexin V-/PI-）、早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）进行定量分析，利用乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测试剂盒检测细胞LDH含量；继续利用PPARα过表达N2a细胞系(进行实验，通过CCK8法检测N2a^PPARα+/+经OGD/R诱导后细胞活力的变化，通过Western blot检测N2a^PPARα+/+经OGD/R诱导后泛凋亡相关蛋白的表达，通过Co-IP实验测定不同PPARα含量下泛凋亡体的聚集；最后，取WT小鼠及神经元PPARα特异性敲除（CKO）小鼠经大脑中动脉闭塞术（MCAO）后的脑切片，共染神经元标志物NeuN及N-GSDMD、Cleaved-Caspase-3等，并定量分析。结果：多重免疫荧光技术表征显示缺血后神经元存在典型的泛凋亡体形成，Western blot检测提示，相比于WT原代神经元，PPARα敲除原代神经元OGD/R后泛凋亡相关蛋白表达升高（P<0.01,P<0.05）。CCK8结果显示，相比于OGD/R模型组，GW6471给药组表现出剂量依赖的细胞活力下降，而PPARα敲低在不同OGD/R造模条件下均诱导显著的细胞活力下降，同时PPARα敲低诱导N2a细胞在OGD/R条件下表现出更明显的泛凋亡体聚集以及更显著的泛凋亡相关蛋白表达上调（P<0.01,P<0.05）。Annexin V-/PI-和Annexin V+/PI-定量分析结果显示，与WT组相比，KO组早期凋亡细胞比例显著升高（P<0.01,P<0.05）;KO LV-PPARα组早期凋亡细胞比例较KO LV-EGFP组有显著下降，与KO LV-EGFP组相比，KO LV-PPARα组细胞释放的LDH含量显著下降（P<0.01,P<0.05）。CCK8结果显示，PPARα过表达显著提升了OGD/R后N2a细胞活力，Western blot结果表明，PPARα过表达显著抑制了OGD/R诱导的泛凋亡相关蛋白上调（P<0.01,P<0.05）。Co-IP实验结果显示PPARα敲低显著增强了缺血诱导的泛凋亡体聚集，反之PPARα过表达则抑制了缺血诱导的泛凋亡体聚集。荧光半定量结果表明，PPARα CKO小鼠皮层半暗带神经元中N-GSDMD、Cleaved-Caspase-3等表达上调（P<0.01,P<0.05）。结论：PPARα对缺血性脑卒中后神经元泛凋亡具有调节作用。神经元PPARα缺失促进缺血诱导的神经元泛凋亡；反之，神经元PPARα过表达抑制缺血诱导的神经元泛凋亡。

关键词

缺血性脑卒中 / PPARα / 神经元 / 泛凋亡