中枢神经系统发育过程中GNA13基因过表达对皮层功能的影响及其可能的分子机制

摘要

目的：既往研究提示GNA13在人中枢神经系统发育过程中可能具有重要的作用，但发育早期GNA13表达异常对大脑的影响仍不清楚。本研究拟通过人脑类器官（human Cerebral organoids,hCO）中过表达GNA13的方法，进一步探索其对成熟后hCO的影响，并通过将hCO移植入免疫缺陷的小鼠观察其在小鼠社交行为中作用。方法：人来源的诱导多能干细胞（human-induced pluripotent stem cell,hiPSC）通过STEMdiff?Cerebral Organoid Kit诱导分化为hCO。在hCO成熟前（诱导分化的第30天），通过慢病毒注射的方法过表达GNA13基因。然后通过免疫荧光染色检测hCO成熟后TBR1表达量及神经元活动，用RNA测序的方法探索GNA13过表达对基因表达的影响。在培养的第42天、第46天和第50天分别进行了非靶向代谢组学。在hCO成熟后（培养的第50天），分别将过表达GNA13和非过表达GNA13的移植入重度联合免疫缺陷（server combined immunedeficiency,SCID）小鼠。以假手术SCID为对照，在移植手术六周后，用旷场实验和三箱社交实验检测小鼠行为学变化。结果：(1)随着hCO的分化成熟，干细胞特异性标志物SOX2表达量下降,而神经元标记物TUJ1表达量增加，表明皮层类器官的成功诱导。(2)过将慢病毒注射入hCO，成功的过表达了GNA13,且在hCO中过表达GNA13可导致皮层特异性标记物TBR1表达量上调以及皮层活动增强。(3)过表达GNA13后，发现hCO中135个基因表达下调，224个基因表达量上调。下调的基因富集于对刺激的反应、免疫系统过程及发育过程等通路。而上调基因富集于多个神经发育和形态相关的通路，包括：突触后结构的组织、GPCR信号转导通路、感觉器官发育、神经元投射形态发生、突触膜粘附、促进细胞迁移以及中枢神经系统细胞分化等通路。(4)成熟前（D42）差异代谢物主要富集于D-氨基酸代谢、精氨酸生物合成、矿物质吸收及苯丙氨酸-酪氨酸-色氨酸生物合成等代谢通路。随着hCO逐渐倾向于成熟（D46），差异代谢产物更多富集于氨基酸代谢相关通路及神经活性配体-受体相互作用。hCO成熟后，差异代谢产物不仅富集于氨基酸代谢相关通路，也参与了多个兴奋性和抑制性突触的功能。(5)移植过表达GNA13的皮层类器官至SCID小鼠内侧前额叶皮层（medial prefrontal cortex, mPFC），结果发现小鼠社交功能表现出显著退缩。但三组小鼠在焦虑行为及运动能力无差异。结论：(1)发育早期GNA13的表达异常可使成熟后皮层中TBR1表达量上调，增强皮层神经元的激活，这种GNA13/TBR1相互作用可能是WNT信号通路介导的。(2) GNA13过表达可通过多个通路影响大脑皮层的结构和功能，包括：免疫过程、 GPCR信号转导、突出结构、神经细胞的生长、分化及迁移。在皮层未发育成熟期GNA13过表达可影响神经元形态及神经递质生物合成。随着hCO的成熟，GNA13过表达除了影响神经元形态和递质合成外，还可能影响hCO神经元的兴奋/抑制平衡。(3) GNA13过表达hCO移植入小鼠mPFC可导致小鼠社交退缩，将特定处理的脑类器官植入免疫缺陷小鼠或可作为神经精神系统疾病模型建立的新手段，为神经精神系统疾病机制的探索和药物筛选提供有效的工具。