mPFC脑区过表达FYN基因诱导小鼠认知功能损伤及其机制研究

摘要

目的：本研究旨在探索在小鼠内侧前额叶过表达FYN基因对小鼠行为学的影响，以及探讨其在精神分裂症病理生理过程可能的作用机制。方法：本研究采用Cre/loxP技术建立内侧前额叶（mPFC）脑区Fyn基因过表达小鼠模型，在7周龄雄性鼠双侧的mPFC脑区均定位注射腺病毒载体（rAAV-hSyn-CRE-WPRE-hGH pA混合rAAV-EF1a-DIO-Fyn-EGFP-WPRE-hGH pA）过表达Fyn基因（Fyn-OE组），空载组小鼠注射空载病毒（rAAVhSyn-CRE-WPRE-hGH pA混合rAAV-EFla-DIO-EGFP-WPRE-hGH pA）作为对照（Vehicle组/FV组），在该脑区的成熟神经元过表达Fyn基因，取出脑组织冰冻切片荧光显微镜下验证注射部位，再通过RT-qPCR及WB验证过表达效果。注射病毒3周后开始一系列行为实验，包括新奇物体识别实验（NORT）、社交行为测试（SIT）、旷场实验（OFT）、水迷宫测试（MWM）等行为学测试并与空载组进行比较，使用光纤记录检测实验小鼠进行新物体识别任务时神经元钙信号活动的变化。待行为实验结束后，取出小鼠的完整脑组织进行高尔基染色，观察mPFC脑区神经元树突长度、树突棘密度变化并对树突棘分型比较。取出小鼠双侧前额叶皮层组织，利用RNA测序技术（RNA-seq）对实验小鼠前额叶组织中的总RNA进行转录组学分析，分析差异基因表达情况，分别进行RTqPCR及Western Blot验证差异基因。结果：1. mPFC脑区过表达Fyn基因小鼠行为学实验。(1) Fyn-OE小鼠出现认知相关行为改变：新物体识别测试中，Fyn-OE组小鼠新物体识别指数(DI)比Vehicle组降低，识别新物体的能力下降。在Morris水迷宫实验中，Fyn-OE组小鼠在训练阶段表现出更长的逃避潜伏期才能找到平台，在测试阶段，相对于Vehicle组小鼠，Fyn-OE组小鼠探索平台象限时间更少，跨越平台区域的次数也更少。综合新物体识别以及水迷宫实验结果，在小鼠mPFC过表达Fyn基因后影响了小鼠的学习记忆功能，导致了小鼠的认知功能损伤。(2)旷场实验及社交行为测试：在旷场实验中，Fyn-OE组小鼠与Vehicle组小鼠在中央区探索时间以及运动距离没有表现出差异。三箱社交实验中，两组小鼠社交指数没有差异，两组小鼠表现出相似的社交好奇心和社交新颖性。2. mPFC脑区过表达Fyn基因影响神经元钙信号。Fyn-OE组小鼠在接触新物体与熟悉物体时钙信号活动没有差异，而空载组小鼠在接触新物体时钙信号活动比熟悉物体时高，Fyn-OE组小鼠钙信号活动出现了变化。3. RNA-seq及差异基因分析结果。在差异表达基因中，排在前几位的上调基因与乙酰胆碱受体相关，包括乙酰胆碱受体亚基Chrnb4、Chrnb3、Chrna3。4.差异基因验证。分别通过RT-qPCR和WB实验验证，发现Chrnb3 mRNA也显著升高，Chrnb3蛋白相对表达量升高。5. mPFC脑区过表达Fyn基因后神经元突触树突棘密度变化。高尔基染色显示Fyn-OE组相对于Vehicle组神经元的树突棘密度增加，树突棘分型结果显示，主要是蘑菇型树突棘数量增加。结论：在小鼠mPFC脑区过表达Fyn基因，介导小鼠出现新物体识别能力下降、水迷宫中空间记忆能力下降，Fyn过表达组小鼠行为出现认知损伤。测序发现Fyn基因过表达导致乙酰胆碱受体相关的基因上调，通过实验验证了差异基因Chrnb3的表达量升高。mPFC脑区过表达Fyn基因的小鼠，在进行新物体识别实验时神经元钙信号出现异常。高尔基染色提示过表达Fyn基因后神经元突棘密度增加，其中主要是蘑菇型树突棘密度增加较为明显。本研究从行为学测试、差异基因、分子表达量、钙信号活动以及树突棘密度的变化方面探索了Fyn过表达导致的影响，推测Fyn过表达可能与精神分裂症患者出现认知损伤有一定的关系，而认知损伤也是精神分裂症患者的一项重要表现。