灰叶酸靶向N型钙通道和脊髓背角甘氨酸受体发挥镇痛活性的机制

摘要

目的：临床上现有的单靶点镇痛化合物存在疗效不足或副作用较大的问题。靶向疼痛信号通路中多种离子通道靶点的化合物能起到减毒增效的作用，在临床上可能更有优势。前期通过FLIPR高通量筛选，发现来源于地花菌的灰叶酸（GA）可以显著调节Cav2.2通道和甘氨酸受体。本研究主要评价GA的镇痛活性并探究其发挥镇痛活性的外周和中枢机制。方法：在福尔马林炎性疼痛模型和完全弗氏佐剂（CFA）诱导的热和机械痛觉过敏模型上评价GA的镇痛活性。在重组细胞和背根神经节（DRG）神经元，利用单细胞膜片钳技术测定GA对Cav2.2通道及甘氨酸受体的效能；同时评价GA对Cav2.2通道动力学和使用依赖性的影响，并确定其在甘氨酸受体上的结合位点。制备sham组和CFA组小鼠的脊髓切片，测定GA对lamina II脊髓背角神经元上甘氨酸受体的效能，并评价GA对甘氨酸能微小抑制性突触后电流（Glycinergic mIPSC），微小兴奋性突触后电流（mEPSC）及自发兴奋性突触后电流（sEPSC）的影响。结果：在多种小鼠疼痛模型中，GA的镇痛活性与阳性药吲哚美辛相当，并优于卡马西平。电生理结果表明GA对Cav2.2通道失活态的IC50为（0.82±0.03）μmol·L^-1，其可以显著降低DRG神经元动作电位的发放频率，抑制高电压激活的钙通道，并且可使重组细胞上Cav2.2通道的慢失活曲线显著向超极化方向移动。在1 Hz, 3 Hz和10 Hz的刺激频率下，GA均显示出对Cav2.2通道电流的使用依赖性阻断。同时，GA对α1/α2/α3三种亚型甘氨酸受体和脊髓背角神经元上甘氨酸受体的EC₅₀<1μmol·L^-1，并且其在α1/α3甘氨酸受体上的结合位点与乙醇的作用位点高度重合。此外，与sham组相比，CFA组小鼠脊髓切片lamina II脊髓背角神经元Glycinergic mIPSC的频率显著降低，GA在不影响mEPSC频率和幅度的情况下可以显著增强CFA组小鼠Glycinergic mIPSC的频率。进一步研究显示，GA还可以显著降低CFA组小鼠脊髓切片lamina II神经元sEPSC的频率和幅度。结论：GA展现出良好的镇痛活性，其机制可能与抑制DRG神经元上的Cav2.2通道和增强脊髓背角的甘氨酸能突触传递有关。

关键词

灰叶酸 / 疼痛 / Cav2.2 / 甘氨酸受体 / 背根神经节 / 脊髓背角