一种牦牛原代肺成纤维细胞分离培养与鉴定的方法

摘要

旨在建立牦牛原代肺成纤维细胞(YLFS)体外分离培养、传代纯化及鉴定的方法.采用I型胶原酶和胰酶混合消化并结合差速消化法分离纯化YLFS;统计细胞冻存及复苏后活率；苏木精-伊红(HE)染色鉴定细胞形态；CCK8溶液检测细胞生长活力；免疫荧光、RT-PCR、Western blot法鉴定成纤维细胞标志性基因波形蛋白(Vimentin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达；β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老.细胞在第2 d逐渐贴壁生长，第4 d贴壁范围呈漩涡状扩大；差速消化法重复2～3次即可纯化YLFS;冻存复苏后的细胞活力均维持在90%以上；HE染色YLFS,细胞形态多为树杈型、长梭形以及不规则四边形；细胞生长状态良好，生长曲线呈“S”型；Vimentin和α-SMA在YLFS的基因及蛋白水平均高度表达；第13代YLFS细胞衰老染色结果呈阳性.本实验成功分离培养出大量活力良好的牦牛肺成纤维细胞，建立了成年牦牛肺成纤维细胞体外分离培养的方法，为进一步研究牦牛肺在单细胞水平的高原适应性机制提供生物材料.

关键词

牦牛 / 原代培养 / 肺成纤维细胞 / 分离 / 培养 / 鉴定 / 酶消化法