兔出血症病毒2型感染的肝组织外泌体提取方法比较

摘要

为了高效地分离得到兔出血症病毒2型感染后的肝组织外泌体，比较使用EDTA-2 Na螯合法（EDTA-EX）、胶原酶酶解法（胶原酶-EX）和PEG-6000聚合物沉积法（PEG-EX）结合差速离心法提取和富集外泌体的效果，并通过细胞表面标记的蛋白免疫印迹、纳米颗粒粒径分析和透射电镜技术对提取得到的外泌体样品进行表征鉴定.同时，通过实时荧光PCR、免疫荧光试验（IFA）及细胞感染试验确认外泌体中携带的病毒粒子数量及感染性.结果显示，PEG-6000聚合物沉积法、EDTA-2 Na螯合法和胶原酶酶解法均能提取和富集得到形态结构完整，浓度和纯度较高的外泌体.3种方法提取外泌体的所需时间分别为（331.6±7.96）min、（485.2±4.21）min和（390±7.68）min,样本中的外泌体总蛋白浓度分别为（7.61±1.09）μg/μL、（1.48±0.52）μg/μL和（0.55±0.18）μg/μL.实时荧光PCR的检测结果显示，PEG-EX、EDTA-EX和胶原酶-EX中的RHDV2病毒载量分别为1×10^7.15 copies/mL、1×10^7.11 copies/mL和1×10^6.6 copies/mL.为了确认得到的外泌体仍具有感染性，将经CD63磁珠纯化得到的外泌体（pCD63-EX）接种RK13细胞，IFA检测可观察到细胞中RHDV2-VP60蛋白的特异性绿色荧光.相比纯化的RHDV2病毒粒子，pCD63-EX感染细胞后的病毒增殖活力要更高.结论：3种方法均能从兔肝组织中分离出携带RHDV2病毒粒子的外泌体.PEG-6000聚合物沉淀法对肝组织外泌体的提取效率更高（操作时间更短、富集率和质量更高）,携带的病毒粒子数量也较多，而携带病毒的外泌体保有对宿主细胞的感染性，这也为后续病原学研究提供了方法学和物质基础.

关键词

外泌体 / 兔病毒性出血症2型 / 富集方法 / 纳米颗粒表征 / 感染性