工程化OMEGA-TnpB系统的构建及体外靶向MDM2基因抑制骨肉瘤细胞恶性生物学行为的研究

摘要

背景 传统治疗手段对晚期、复发及转移性骨肉瘤患者的治疗效果有限。基因治疗为骨肉瘤提供了新的治疗选择。然而，现有基因编辑工具(如CRISPR-Cas9)因尺寸大、免疫原性高等问题限制了其临床应用。新发现的OMEGA-TnpB系统具有紧凑的尺寸(约400 aa)，在肿瘤基因编辑中展现出巨大潜力。目的 通过改造OMEGA-TnpB系统，开发高效、紧凑的基因编辑工具，并验证其在骨肉瘤基因治疗中的应用潜力。方法 通过理性设计获取TnpB突变体。利用单链退火(single strand annealing,SSA)报告系统筛选突变体，并在HEK293T和骨肉瘤细胞系(143B)中验证其编辑效率。最后使用优化的TnpB突变体敲除骨肉瘤基因MDM2，通过RT-qPCR、流式细胞术、CCK-8、划痕实验和Transwell实验评估其对细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响。结果 筛选出多个高活性TnpB突变体，其中ISYmu1-L225K在HEK293T细胞(P<0.01)和143B细胞(P<0.01)中的编辑效率显著高于enOsCas12f1，在HEK293T细胞部分位点与SpCas9比较无统计学差异。敲除MDM2基因后，骨肉瘤细胞的增殖能力下降(P<0.01)，凋亡率增加(P<0.01)，迁移(P<0.01)和侵袭(P<0.05)能力被抑制。结论 成功获取了在哺乳动物细胞内基因编辑效率提高的TnpB突变体ISYmu1-L225K，验证了ISYmu1-L225K能够靶向敲除MDM2基因并抑制骨肉瘤细胞的恶性行为，为骨肉瘤的精准治疗提供了新思路。

关键词

OMEGA-TnpB系统 / MDM2基因 / 骨肉瘤 / 基因治疗 / 基因编辑