胰岛素样生长因子结合蛋白2对高血糖环境诱导人足细胞凋亡的影响及机制研究

摘要

背景 糖尿病肾病患者日益增加，仍有患者在现有治疗中进展为终末期肾病，因此迫切需要新型治疗靶点。目的 探讨胰岛素样生长因子结合蛋白2(insulin like growth factor binding protein 2,IGFBP2)对高血糖环境诱导人足细胞凋亡的影响及机制。方法 体外培养的人足细胞随机分为正常血糖(normal glucose,NG)组(5 mmol/L)以及高血糖(high glucose,HG) 24 h组、HG 48 h组、HG 72 h组(30 mmol/L)。采用RT-qPCR法检测IGFBP2、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)和细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1) mRNA表达水平，Western blot检测IGFBP2和Cleaved Caspase 3蛋白表达水平，以此确定后续实验HG处理的最佳时间点。将IGFBP2小干扰RNA转染进入足细胞并分为NG组、阴性对照干预组(NG-NC-siRNA)、IGFBP2敲低siRNA干预组(NG-IGFBP2-siRNA1、NG-IGFBP2-siRNA2、NGIGFBP2-siRNA3),RT-qPCR检测IGFBP2 mRNA表达水平，选择敲低效率最高的IGFBP2-siRNA用于后续实验。根据实验内容将足细胞随机分为：(1)NG组和HG组；(2)NG组和NG+125ng/mLrhIGFBP2组；(3)HG组和HG-IGFBP2-siRNA组。(1)(2)(3)均通过RT-qPCR检测TNF-α和ICAM-1 mRNA表达水平，JC-1染色法检测线粒体膜电位，共聚焦显微镜检测线粒体超氧化物和活性氧荧光强度，流式细胞术检测细胞凋亡率。结果 随HG处理时间增加，RT-qPCR结果 显示IGFBP2、TNF-α和ICAM-1 mRNA水平随时间升高，Western blot结果 显示IGFBP2和Cleaved Caspase 3蛋白水平随时间升高。与NG组比较，RT-qPCR结果 显示IGFBP2、TNF-α和ICAM-1均在HG 72 h时m RNA水平最高(P<0.05),Western blot结果 显示IGFBP2在HG 72 h时和Cleaved Caspase 3在HG 48 h时蛋白水平最高(P<0.05)，据此选72 h为后续实验诱导时间点。RT-qPCR检测结果 显示，与NG组相比，阴性对照干预组m RNA表达无统计学差异(P>0.05),NG-IGFBP2-siRNA2组IGFBP2 mRNA表达水平最低(P<0.05)，敲除效率最高，因此选择IGFBP2-siRNA2进行后续实验。与NG组相比较，HG组线粒体膜电位绿/红色荧光强度比值、线粒体超氧化物和活性氧荧光强度以及细胞凋亡率均增强(P<0.05)。与NG组相比较，NG+125 ng/mL rhIGFBP2组的TNF-α和ICAM-1 mRNA水平、线粒体膜电位绿/红色荧光强度比值、线粒体超氧化物和活性氧荧光强度以及细胞凋亡率均升高(P<0.05)。与HG组相比较，HG-IGFBP2-siRNA组的TNF-α和ICAM-1m RNA表达水平、线粒体膜电位绿/红色荧光强度比值、线粒体超氧化物和活性氧荧光强度以及细胞凋亡率均降低(P<0.05)。结论 敲除IGFBP2后通过减弱高血糖处理下的线粒体功能紊乱和氧化应激降低人足细胞凋亡，因此抑制IGFBP2的表达有望成为糖尿病肾病的潜在治疗策略。

关键词

胰岛素样生长因子结合蛋白2 / 线粒体损伤 / 氧化应激 / 细胞凋亡 / 糖尿病肾病

基金资助

国家自然科学基金面上项目(62271506;82070741;82270758);; 国家重点研发计划项目(2021YFC1005300;2021YFC1005302;2018YFE0126600);; 北京朝阳医院金种子项目(CYJZ202203)