衰老小鼠骨骼肌组织外泌体对骨代谢调控作用的研究

摘要

背景 骨骼肌衰老后质量和功能逐渐下降，其分泌的外泌体对骨代谢具有明显的影响，但衰老骨骼肌外泌体对骨代谢的调控机制尚未明确。目的 探索衰老骨骼肌组织外泌体调控成骨、破骨细胞功能的作用。方法 将2月龄(Young)和24月龄(Old)小鼠骨骼肌组织消化形成单细胞悬液，从中提取的骨骼肌组织外泌体分别为年轻骨骼肌组织外泌体(Young-Exo)和衰老骨骼肌组织外泌体(Old-Exo)。通过生物透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)、纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)和Western blot对外泌体进行验证。利用提取的外泌体干预诱导原代成骨细胞成骨分化和诱导骨髓单核巨噬细胞向破骨细胞分化。组织外泌体干预实验分为对照组(PBS组)、年轻组织外泌体组(YoungExo组)、衰老组织外泌体组(Old-Exo组)。茜素红(alizarin red S,ARS)染色和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色检测成骨分化水平；抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphase,TRAP)染色检测破骨细胞面积；实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测Alp、Opn、Ocn、Col1a1、Runx2、Ctsk、Dc-stamp、Atp6v0d2、Mmp-9、Acp5基因相对表达量。结果 Young-Exo组与Old-Exo组的细胞外囊泡均为双层膜结构的圆形囊泡，直径110 nm左右，且均表达CD9、CD63、CD81和TSG101等外泌体相关标志蛋白。组织外泌体干预诱导原代成骨细胞成骨分化实验结果显示，与PBS组、Young-Exo组比较，Old-Exo组原代成骨细胞ARS染色的钙盐沉积量和ALP染色强度均下降(P<0.01)，成骨分化基因Alp、Opn、Ocn、Col1a1、Runx2的mRNA相对表达量降低(P<0.01)；组织外泌体干预诱导骨髓单核巨噬细胞向破骨细胞分化结果显示，与PBS组、Young-Exo组比较，Old-Exo组TRAP染色的破骨细胞所占面积百分比升高(P<0.01)，破骨细胞相关基因Ctsk、Dc-stamp、Atp6v0d2、Mmp-9、Acp5的mRNA相对表达量升高(P<0.01)。结论 与年轻骨骼肌组织外泌体相比，衰老骨骼肌组织外泌体可能通过抑制原代成骨细胞的成骨分化、促进破骨细胞形成，打破骨代谢的动态平衡，导致骨质疏松症。

关键词

衰老 / 骨骼肌 / 组织外泌体 / 成骨分化 / 破骨细胞