基于线粒体能量代谢探讨温阳解郁颗粒对抑郁模型大鼠的作用机制研究

Study on the mechanism of Wenyang Jieyu Granules in depression model rats based on mitochondrial energy metabolism

摘要

目的 基于线粒体能量代谢探讨温阳解郁颗粒对CUMS大鼠抗抑郁作用机制。 方法 通过旷场实验行为学评分将48只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、氟西汀组和温阳解郁颗粒低、中、高剂量组，每组8只。除正常组外，其余各组均采用慢性不可预见性刺激联合孤养法建立抑郁模型，在连续28 d的造模期间同步予大鼠灌胃给药；并在第0、14、28天观察大鼠一般情况，检测体质量、旷场行径总路程、旷场静止时间、新环境进食抑制实验等相关指标；采用ELISA法测定海马组织中三磷酸腺苷（ATP）、总ATP酶、可溶性腺苷酸环化酶（sAC）、丙酮酸、乳酸、活性氧含量；采用Western blot法测定大鼠海马组织中G蛋白偶联雌激素受体（GPER）、跨膜结合型腺苷酸环化酶（tmAC）、蛋白激酶A催化亚基（PKA C）的蛋白表达水平，分析环磷酸腺苷（cAMP）信号通路相关蛋白表达变化。 结果 与正常组比较，模型组大鼠体质量降低、旷场活动减少、静止时间延长、新环境进食抑制时间延长（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）；其海马组织中能量代谢指标ATP、总ATP酶、sAC和丙酮酸及cAMP信号通路相关蛋白GPER、tmAC、PKA C表达均下调（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）；氧化应激产物乳酸、活性氧水平显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，温阳解郁颗粒各剂量组及氟西汀组均可增加大鼠体质量，改善行为学表现（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），调节能量代谢及cAMP信号通路相关蛋白表达（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），降低氧化应激水平（P＜0.05，P＜0.01）。 结论 温阳解郁颗粒可明显调控线粒体能量代谢，增加能量储备、保护海马神经元，进而发挥抗抑郁作用。

Abstract

Objective To explore the antidepressant mechanism of Wenyang Jieyu Granules on chronic unpredictable stimulation (CUMS) rats based on mitochondrial energy metabolism. Methods 48 male SD rats were randomly divided into the normal group, the model group, the Fluoxetine group and the low, medium and high-doseWenyang Jieyu Granules groups by open-field test behavioral score, with 8 rats in each group. Except for the normal group, the other groups received CUMS combined with solitary rearing to establish a depression model. During the 28-day continuous modeling process, rats were simultaneously administered via intragastric gavage. The general condition of the rats was observed on days 0, 14 and 28, and the body mass, the total distance traveled in the open field, the static time in the open field, and the new environment eating inhibition experiment were measured. The contents of adenosine triphosphate (ATP), total ATPase, soluble adenylate cyclase (sAC), pyruvate, lactic acid and reactive oxygen species in hippocampus were determined by ELISA. Western blot was used to determine the protein expression levels of G protein-coupled estrogen receptor (GPER), transmembrane-bound adenylate cyclase (tmAC) and protein kinase A catalytic subunit (PKA C) in rat hippocampus to evaluate the expression changes of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) signaling pathway-related proteins. Results Compared with the normal group, the model group showed depression-like behaviors such as decreased body weight, reduced open-field activity, prolonged resting time, and prolonged inhibition time of eating in the new environment (P<0.05, P<0.01, P<0.001). The expression levels of energy metabolism indicators ATP, total ATPase, sAC and pyruvate, and cAMP signaling pathway-related proteins GPER, tmAC and PKA C in hippocampus were decreased (P<0.05, P<0.01, P<0.001). The levels of oxidative stress products lactic acid and reactive oxygen species were significantly increased (P<0.01). Compared with the model group, each dose group of Wenyang Jieyu Granules and the Fluoxetine group could increase body weight and improve behavioral performance (P<0.05, P<0.01, P<0.001); The above groups could regulate energy metabolism and cAMP signaling pathway-related protein expression (P<0.05, P<0.01, P<0.001); And the avove groups decreased the level of oxidative stress (P<0.05, P<0.01). Conclusion Wenyang Jieyu Granules can significantly regulate mitochondrial energy metabolism, increase energy reserves, and protect hippocampal neurons, thereby exerting antidepressant role.

Graphical abstract

关键词

抑郁症 / 慢性不可预知温和应激 / 能量代谢 / 温阳解郁颗粒

Key words

depression / chronic unpredictable stimulation / energy metabolism / Wenyang Jieyu Granules

抑郁症是一种以情绪低落、悲观厌世为主要表现的神经精神类疾病，具有高发病率、高致残率、高自杀率、高复发率等特征^[1]，其主要特征是情绪低落、快感缺失，以及体质量减轻、睡眠不足、言语动作减少等情感和行为障碍^[2]，通常需要长期维持药物治疗。目前虽有多种治疗策略，但近50%的患者经治疗后未能缓解^[3]。

研究^[4-5]表明，抑郁症发病机制与线粒体能量代谢障碍有关。线粒体是细胞的“动力工厂”，在正常的线粒体膜电位维护下，通过三羧酸循环及氧化磷酸化过程将生物体内的糖、脂肪及蛋白质三大营养物质的能量代谢连接起来，在此基础上合成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），以供应生物体内绝大部分的能量需求。海马体是大脑颞叶内负责记忆、情感等功能的区域，抑郁样行为通常伴有海马神经元数量减少、神经分化异常。在海马神经元发育过程中，其增殖和分化功能依赖于高能量代谢。持续外界不良刺激可导致ATP产生减少、活性氧增加，影响大脑各区域的线粒体在平衡和执行神经元之间有效信息的能量传递，进而降低海马神经可塑性，引起精神症状加重、躯体症状泛化^[6]，因此，线粒体能量代谢障碍被认为是抑郁症发生发展的核心病理环节。环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）作为细胞内重要的第二信使，在调控线粒体能量代谢及神经可塑性方面发挥核心作用^[7]。cAMP的生成依赖于腺苷酸环化酶（adenylyl cyclase，AC）催化ATP转化，其中跨膜型腺苷酸环化酶（transmembrane adenylyl cyclase，tmAC）主要接受G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor，GPCR）的信号调控。G蛋白偶联雌激素受体（G protein-coupled estrogen receptor，GPER）作为GPCR家族成员之一，近年来被发现广泛表达于海马神经元，并参与调节线粒体功能及能量代谢^[8]。研究^[9]表明，cAMP信号通路的激活可促进下游蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）的磷酸化，进而调节突触可塑性，这被认为是其抗抑郁作用的重要机制之一。

中医理论认为，阳气是人体生命活动的根本动力，阳虚则会导致能量代谢障碍和多种疾病的发生；现代研究^[10]表明，线粒体作为细胞能量代谢的中心细胞器，其功能障碍与阳虚证候密切相关，而具有温阳作用的中药可通过调节线粒体功能发挥治疗作用，如调节细胞凋亡、清除活性氧、增强ATP合成等。温阳解郁颗粒由桂枝、附子、乌梅、炙甘草、大枣、生姜六味中药组成，由山西省经方扶阳创始人赵杰根据清末郑钦安《医法圆通》之补坎益离丹化裁而来，具有复肾阳、补肝阳、暖心阳、运脾阳，收纳微阳于肾，伏虚火于中的功效^[11]，可缓解因长期生活压力、精神紧张导致的阳气不足。课题组前期已通过临床研究证实温阳解郁方可明显改善抑郁患者症状，且不良反应少、安全性高^[12]；动物实验^[13]亦显示该方可改善CUMS模型大鼠的抑郁样行为，其作用机制可能与调控cAMP信号通路有关。然而，cAMP作为能量感受分子，其合成高度依赖底物ATP供给，该通路上游能量基础尚待阐明。基于上述背景，本研究在前期工作基础上，以线粒体能量代谢为切入点，采用CUMS模型大鼠，观察温阳解郁颗粒对海马组织ATP、总ATP酶、丙酮酸、乳酸、活性氧、tmAC、可溶性腺苷酸环化酶（soluble adenylyl cyclase，sAC）、GPER表达的影响，旨在从能量代谢角度揭示该方抗抑郁的作用机制，为温阳解郁颗粒的临床应用提供更充分的科学依据。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级SD健康雄性大鼠48只，体质量（158±7.59）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号SCXK（京）2021-0011。于山西中医药大学动物实验室内饲养，饲养室温度24℃，湿度50%～60%，明暗交替12 h/12 h，空气流通，适应性喂养7 d，期间自由摄食饮水。本实验操作过程中严格遵守实验动物伦理标准，实验伦理证号：KYLL-2023-004。

1.2 药品与试剂

温阳解郁颗粒（桂枝、附子、炙甘草、生姜、乌梅、大枣，由山西省中西医结合医院制剂室提供）；氟西汀（礼来苏州制药有限公司，国药准字HJ20160501）；ATP、总ATP酶、丙酮酸、活性氧、乳酸试剂盒（凡科维有限公司，F8511-A、F40175-A、F21457-A、F3686-A、F30238-A）；sAC试剂盒（武汉贝茵莱生物科技有限公司，RA27658）；RIPA裂解液、BCA蛋白定量检测试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司，CR2305131、2306001）；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，2307001）；5×变性SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（博士得生物有限公司，18Q17B12）；ECL Plus超敏发光液（美仑生物技术有限公司，MA0186-Jun-131I）；重组Anti-GPCR 30抗体（美国Abcam公司，AB260033）；重组Anti-cAMP蛋白激酶催化亚基抗体（美国Abcam公司，AB76238）；tmAC抗体（南京巴傲得有限公司，BZ16678）；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔lgG（H+L）（生物世界科技有限公司，BS13278）。

1.3 实验仪器

多色荧光及化学发光凝胶成像系统（美国GE公司，ImageQuan LAS4000）；半干电转印系统（美国GE公司，TE77PWR）；电泳仪（美国GE公司，SE250）；多功能微孔板检测仪（美国BioTeK有限公司，Synergy 4）；电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司，BSA 224S-CW）；行为学实验系统（成都泰盟软件有限公司，TM-Vision）。

2 实验方法

2.1 分组及给药

SD健康雄性大鼠适应性喂养7 d后通过旷场实验行为学评分筛选48只大鼠，随机分为6组，分别为正常组，模型组，温阳解郁颗粒低、中、高剂量组，氟西汀组，每组8只。除正常组外，其余各组均参考文献[14]采用CUMS联合孤养法建立抑郁模型，造模方法：4℃冷水游泳5 min；禁食24 h；禁水24 h；夹尾10 min；45℃热刺激10 min；水平震荡10 min；悬尾5 min；湿笼24 h。每日随机采用一种方式，使动物无法预知即将发生的刺激。造模同时给予相应药物灌胃，共持续28 d。温阳解郁颗粒低、中、高剂量组大鼠给药剂量分别为0.94、1.88、3.76 g·kg^-1。氟西汀组大鼠给药剂量为2.08 mg·kg^-1。正常组及模型组大鼠给予等量蒸馏水。灌胃体积均为10 mL·kg^-1，每日1次，连续28 d（温阳解郁颗粒成人给药剂量为每日3次，每次6 g，大鼠药物剂量依据成人临床等效剂量换算得出）。

2.2 大鼠一般情况观察

实验过程中，观察各组大鼠的精神状态、毛发、进食、对外界刺激反应等一般情况。

2.3 大鼠行为学指标检测

2.3.1 体质量测定

在实验第0、14、28天称重并记录。

2.3.2 旷场实验

在实验第0、14、28天进行。保持实验环境安静，将大鼠统一从旷场实验箱一角放入，由摄像机观察并记录大鼠在5 min内的活动状况，使用泰盟TM-Vision型行为学软件记录大鼠的旷场行径总路程和静止时间。每只大鼠完成后彻底清洁实验并喷洒75%酒精，避免气味残留对后续大鼠测试的干扰。

2.3.3 新环境进食抑制实验

实验开始前禁食24 h，旷场实验结束2 h后，使用50 cm×50 cm×50 cm的实验箱，将食物放置箱底中央一小块白纸上，固定将大鼠从实验箱一角放入。记录每只大鼠从放入到开始进食的时间，观察5 min，计时结束还没有进食，按5 min计算。每只大鼠检测结束后，喷洒75%酒精清洁实验箱，避免气味残留干扰。

2.4 大鼠样本采集

取材前大鼠禁食禁水12 h，2%戊巴比妥钠麻醉后快速断颈处死，在冰盘上剥离大鼠的大脑组织并迅速分离出海马组织，装入冻存管后立即液氮速冻，待全部取材完成后转移至-80℃冰箱中冻存，备用。

2.5 ELISA法检测大鼠海马组织中ATP、总ATP酶、sAC、丙酮酸、乳酸、活性氧含量

取2.4项下各组大鼠的海马组织样品适量，采用ELISA法，严格按照试剂盒说明书操作，检测其海马中ATP、总ATP酶、sAC、丙酮酸、乳酸、活性氧的含量。

2.6 Western blot法测定大鼠海马组织中GPER、tmAC、PKA C的蛋白表达

于第28天行为学测定结束后，取2.4项下各组大鼠海马组织样品适量，RIPA裂解液提取蛋白、二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid assay，BCA）测定蛋白浓度；上样、电泳、转膜、封闭后，分别加入GAPDH（1∶5 000稀释），GPER、tmAC、PKA C一抗（1∶1 000稀释），4 ℃冰箱孵育过夜；次日回收一抗，TBST洗涤3次，每次5 min，加山羊抗兔二抗（1∶5 000）孵育、洗膜等处理后，使用超敏ECL发光液显影，成像仪摄像、测量，计算积分光密度灰度值。

2.7 统计学方法

实验数据使用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析。所有数据先进行正态性检验（Shapiro-Wilk检验）和方差齐性检验（Levene检验）。若数据符合正态分布且方差齐性，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用最小显著性差异法（LSD法）或Dunnett-t检验；若数据不符合正态分布或方差不齐，则采用Kruskal-Wallis非参数检验进行多组间比较，组间两两比较采用Dunn's多重比较检验。数值用均值±标准差（\overline{x}±s）表示，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 大鼠一般情况观察结果

正常组大鼠活动自如，皮毛光滑，反应灵敏。模型组大鼠精神萎靡，活动减少，皮毛粗糙，反应迟钝，脱毛明显。与模型组相比，温阳解郁颗粒低剂量组大鼠一般状况有所改善，但仍存在活动减少、毛色欠佳等状态；温阳解郁颗粒中、高剂量组大鼠精神、活动能力、毛色等整体改善良好，状态接近正常组。氟西汀组大鼠一般情况亦明显改善，行为状态及外观体征与正常组相近。

3.2 温阳解郁颗粒对大鼠体质量的影响

见图1。

3.3 温阳解郁颗粒对大鼠旷场行径总路程的影响

见图2。

3.4 温阳解郁颗粒对大鼠旷场静止时间的影响

见图3。

3.5 温阳解郁颗粒对大鼠新环境进食抑制时间的影响

见图4。

3.6 温阳解郁颗粒对大鼠海马组织中ATP、总ATP酶、sAC、丙酮酸、乳酸、活性氧含量的影响

见图5。

3.7 温阳解郁颗粒对大鼠海马神经元中GPER、tmAC、PKA C蛋白表达的影响

见图6。

4 讨论

2020年全球范围内重度抑郁症人群较之前增加28%，全球超过3.5亿人受抑郁症困扰，已成为世界第四大疾病，且还在快速增长中^[15]。抑郁症已成为世界范围内致残的主要原因，相关的不良结局包括角色转换困难、角色功能下降、继发性躯体疾病以及自杀等^[16-17]。抑郁症患者自杀的死亡风险是普通人群的20倍以上，终身自杀风险达15%，在自杀死亡案例中占比高达70%^[18]。

抑郁症的发生是一个复杂的过程，其病因及发病机制目前尚不明确，当前抗抑郁药的研制和应用主要依赖于单胺递质学说^[19-20]，但是临床疗效有限，存在不良反应。传统上中医辨治抑郁，多落于肝气郁结的窠臼，常以疏肝解郁、怡情易性为主要治疗方法，面对多变的临床实际情况，往往难以取得较好的长期疗效。抑郁症患者不论是在发病前还是在发病过程中，常存在“阳气烦劳则张”的状态，当阳气被消耗到一定程度，机体转而以一种机能低下的方式运作，反而更进一步损耗阳气，陷入恶性循环。温阳解郁方中以附子、桂枝入心经，通达心阳；乌梅引诸药入肝经，使神归其舍；生姜辛温、大枣甘平，两者合用，温补中焦；炙甘草调和药性，合桂枝辛甘化阳温补心肝之阳，合乌梅酸甘化阴滋养肝心之体，六药合用则诸郁得解。

阳气作为机体生命活动的原动力，其温煦推动作用与线粒体能量代谢存在内在关联，越来越多的研究发现抑郁症患者普遍存在线粒体功能障碍及ATP生成减少，这与中医“阳气不足则神机失养”的观点高度契合。长期暴露在慢性应激环境中，脑区神经元的线粒体功能和完整性会受到严重损害，而诱发神经突触连接紊乱、神经传导异常，导致精神疾病长期恶化^[21]。因此，本研究创新性地将中医“温阳”理论与现代能量代谢研究结合，选用CUMS大鼠模型进行验证。结果显示模型组大鼠精神疲乏、活动量明显减少、双目暗淡、皮毛粗糙萎黄、食量减少、反应迟钝、脱发明显，体质量降低、旷场行径总路程显著缩短、旷场静止时间、新环境进食潜伏时间显著延长。温阳解郁颗粒干预后，大鼠体质量增加、旷场活跃性明显提高，新环境进食潜伏时间缩短。因此，温阳解郁颗粒有明显的抗抑郁作用。

线粒体是神经元功能维持与可塑性的核心驱动力。生理状态下，神经元高度依赖线粒体氧化磷酸化系统高效合成ATP，以满足其高能耗需求^[22-23]。在此过程中，电子传递链伴随产生少量活性氧，生理浓度的活性氧在信号传导中发挥重要作用^[24]。更重要的是，活跃的线粒体代谢产生的代谢物可激活sAC，催化ATP生成cAMP，形成局部“代谢-cAMP信号微域”。该信号微域能够激活下游PKA等效应分子，进而反馈性促进电子传递链复合物组装、优化氧化磷酸化效率、支持线粒体生物合成，形成“能量代谢-cAMP信号-线粒体功能”的正向调节环路^[25-26]。然而，在慢性应激等病理状态下，这一精密的调节环路遭到破坏。本研究结果显示，CUMS大鼠海马组织中ATP、总ATP酶、丙酮酸及sAC水平显著降低，而乳酸和活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平显著升高。这一结果提示，CUMS大鼠存在显著的线粒体能量代谢障碍。持续应激导致的缺氧状态迫使神经元转向低效的无氧糖酵解供能，表现为ATP生成减少、ATP酶活性下降、乳酸堆积^[27-28]。同时，丙酮酸作为三羧酸循环的底物，其含量下降直接反映了线粒体有氧氧化功能受损。sAC作为连接能量代谢与cAMP信号的“能量感受器”，其表达水平的下调意味着“代谢-cAMP信号”转换效率降低，本应发挥正向调节作用的信号微域被削弱，进一步加剧线粒体功能障碍与氧化损伤。过量堆积的ROS不仅无法履行信号传导功能，反而因其强氧化性攻击线粒体膜结构和电子传递链酶复合物，形成“能量耗竭-氧化损伤”的恶性循环，最终导致神经能量供应严重不足，损害突触可塑性与神经环路功能^[29]。温阳解郁颗粒干预后，上述异常指标得到显著逆转。与模型组相比，温阳解郁颗粒各剂量组及氟西汀组大鼠海马组织中ATP、总ATP酶、丙酮酸及sAC水平均显著回升，同时乳酸与活性氧的堆积明显减少。且温阳解郁颗粒高剂量组改善效果显著，与氟西汀组相当甚至更优。这一结果表明，温阳解郁颗粒能够从多个层面修复线粒体功能障碍：首先，通过改善氧化磷酸化功能，增加能量储备，并促进代谢底物向有氧氧化方向转化；其次，通过增强sAC表达，修复“代谢-cAMP信号”转换环节，为下游信号通路激活提供能量基础；最后，通过降低ROS堆积，打破氧化应激的恶性循环，保护线粒体结构与功能的完整性。

cAMP作为细胞内重要的第二信使，广泛参与能量代谢调控、情绪调节过程，与抑郁症病理机制及干预密切相关。海马作为情绪调节和认知功能的关键脑区，其神经元高度依赖稳定的能量供应，而线粒体能量代谢障碍正是抑郁症中海马功能障碍的重要病理基础之一^[29]。研究^[30]发现，慢性应激可降低cAMP水平，进而破坏血脑屏障完整性并诱发抑郁样行为，而补充外源性cAMP可显著改善上述症状。ATP在腺苷酸环化酶（tmAC、sAC）催化下生成cAMP是细胞能量信号转导的核心反应。其中，tmAC主要定位于细胞膜，活性受GPCR调控。当GPCR与配体结合后，G蛋白的α亚基解离并激活tmAC，催化ATP转化为cAMP，同时在内吞过程中形成“内吞cAMP微域”，这一局部高浓度信号环境可精准调控下游PKA的活性，进而影响突触可塑性与基因表达^[25]。GPER作为GPCR家族成员之一，近年来被发现广泛表达于海马神经元，并参与调节线粒体功能及能量代谢^[8]。而sAC则分布于线粒体或细胞质中，其活性由代谢产物（如碳酸氢盐、钙离子）直接调控，在能量需求旺盛的区域生成cAMP，支持线粒体氧化磷酸化与细胞存活^[31]。因此，作为cAMP主要来源的腺苷酸环化酶（tmAC、sAC），其功能活化对于维持海马等关键脑区神经元的能量稳态至关重要。本研究对cAMP信号通路上游关键元件进行检测，结果显示，与正常组相比，CUMS模型组大鼠海马组织中GPER、tmAC及PKA C的蛋白表达量均显著降低。这一结果提示，慢性应激不仅损害线粒体能量代谢，同时抑制了G蛋白-tmAC-cAMP信号轴的活性，导致cAMP生成能力下降，进而削弱PKA介导的下游神经保护与突触可塑性调节功能。温阳解郁颗粒干预后，上述蛋白表达水平得到显著逆转。与模型组相比，温阳解郁颗粒各剂量组及氟西汀组大鼠海马组织中GPER、tmAC及PKA C的表达量均显著回升，且温阳解郁颗粒高剂量组在各项指标幅度最优改善。

综上所述，温阳解郁颗粒可显著改善CUMS大鼠抑郁样行为，表现出明显的抗抑郁作用。其作用机制与调控线粒体能量代谢密切相关：温阳解郁颗粒能够显著上调海马组织中ATP、总ATP酶、sAC及丙酮酸水平，同时有效降低乳酸与活性氧的堆积，提示其可增加能量储备、改善慢性应激下的缺氧状态、逆转线粒体功能障碍。进一步研究表明，温阳解郁颗粒可通过上调GPER、tmAC及PKA C的蛋白表达，激活tmAC和sAC-cAMP信号通路，为cAMP合成提供充足的能量底物与信号基础，从而发挥保护海马神经元、改善抑郁样行为的作用。本研究从线粒体能量代谢这一上游视角，为“温阳解郁”法治疗抑郁症提供了直接的现代生物学实验依据。

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基金资助

山西省中医药管理局科研课题计划项目(2023ZYYA2006)

经方扶阳山西省重点实验室(202504010931053)

山西省卫生健康委员会卫生健康科研课题(2024132)

山西中医药大学科技创新能力培育计划国家自然基金培育专项(2024PY-NS-022)

山西省卫生健康委员会中医药科技创新工程项目计划(2025kjzy007)