桦褐孔菌人参复配粉提取工艺优化及其对小鼠脾细胞CD69表达的影响

Optimization of the extraction process of Inonotus obliquus and Ginseng compound powder and its effect on CD69 expression in mouse splenocytes

摘要

目的 本研究旨在优化桦褐孔菌人参复配粉的提取工艺，并评价其对脾细胞早期活化标志CD69表达的影响。 方法 以总多糖提取率为指标，采用L₉（3⁴）交互作用实验考察提取时间、用水量、提取次数对总多糖提取率的影响，确定桦褐孔菌人参复配粉的最佳提取工艺。提取小鼠原代脾细胞，CCK-8法测定桦褐孔菌人参复配粉对小鼠脾细胞的活力；设置阴性对照组、荧光减一（FMO）对照组、刀豆蛋白A（ConA）组（2.5 μg·mL^-1）及桦褐孔菌人参复配粉组（100 μg·mL^-1），流式细胞术检测CD69阳性细胞率。 结果 最佳提取工艺为用水量10倍，提取3次，每次1 h，验证实验多糖提取率为1.893%±0.064%。CCK-8实验显示复配粉浓度100 μg·mL^-1时，细胞活力达190.01%±11.95%（P＜0.000 1）。流式细胞术结果显示，桦褐孔菌人参复配粉能够诱导自然杀伤（NK）细胞、巡逻单核细胞和炎性单核细胞的CD69表达显著上调，而几乎不触发CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、B细胞活化。 结论 优化的桦褐孔菌人参复配粉提取工艺为10倍用水量，提取3次，每次1 h，工艺稳定可行，所得复配粉在体外可诱导NK细胞、单核细胞早期活化，具有免疫增强潜力。

Abstract

Objective To optimize the extraction process of Inonotus obliquus and Ginseng compound powder and to evaluate its effect on the expression of the early activation marker CD69 in splenocytes. Methods Using the extraction yields of total polysaccharides as indicators, an L₉(3⁴) interaction experiment was conducted to investigate the effects of extraction time, water volume, and number of extraction cycles on the extraction yields of total polysaccharides, thereby determining the optimal extraction process for Inonotus obliquus and Ginseng compound powder. Primary mouse splenocytes were isolated. The cell viability of Inonotus obliquus and Ginseng compound powder on mouse splenocytes was assessed by Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay. The negative control group, the fluorescence minus one (FMO) control group, the Concanavalin A (ConA) group (2.5 μg·mL^-1), and the Inonotus obliquus and Ginseng compound powder group (100  μg·mL^-1) were set up. The percentage of CD69‑positive cells was detected by flow cytometry. Results The optimal extraction process was water addition of 10 times the material weight, extraction for 3 cycles and 1 hour per cycle, and verification experiments showed that the extraction rate of polysaccharides was 1.893%±0.064%. The CCK-8 assay indicated that at a concentration of 100  μg·mL^-1, the cell viability reached 190.01%±11.95% (P<0.000 1). Flow cytometry results showed that the Inonotus obliquus and Ginseng compound powder significantly upregulated CD69 expression in natural killer (NK) cells, patrolling monocytes, and inflammatory monocytes, while barely triggering the activation of CD4⁺ T cells, CD8⁺ T cells, or B cells. Conclusion The optimized extraction process for the Inonotus obliquus and Ginseng compound powder is extraction with 10-fold water for 3 cycles of 1 hour each. This process is stable and feasible. The resulting compound powder can induce early activation of NK cells and monocytes in vitro, demonstrating potential for immune enhancement.

Graphical abstract

关键词

桦褐孔菌 / 人参 / 免疫调节 / CD69

Key words

Inonotus obliquus / Ginseng / immune regulation / CD69

桦褐孔菌（Inonotus obliquus）又名桦树茸或白桦茸，是一种主要寄生于白桦树上的药食两用真菌，主要分布于北半球寒带地区，在中国主要分布于吉林省长白山地区、黑龙江省大小兴安岭以及内蒙古等地。桦褐孔菌活性成分主要为多糖、黄酮、桦褐孔菌素、多酚等^[1]。现代药理学研究表明，桦褐孔菌具有激活免疫^[2]、抗肿瘤^[3]、降血糖^[4]等多种生物活性。多糖是桦褐孔菌最主要的活性成分之一，其免疫调节作用尤为突出，可通过增强巨噬细胞功能、促进T淋巴细胞功能、增强免疫信号通路等途径增强机体免疫功能^[5-6]。人参（Panax ginseng）为五加科植物人参的干燥根，是我国传统名贵中药材，被誉为“百草之王”，其活性成分人参多糖不仅表现出抗肿瘤、神经保护、心血管保护等多重药理活性^[7]，还能够增强机体非特异性免疫和特异性免疫功能，对免疫细胞具有调节作用^[8]。

中药合理配伍可起到协同增效、减毒增敏的作用。中医理论认为，桦褐孔菌性偏凉、味微苦，归肺、脾、肾三经，扶正祛邪，益气养血^[9]；人参性温，大补元气、补脾益肺。二者配伍，寒温并用，相反相成，人参温补可制桦褐孔菌之凉，防其清解伤正，桦褐孔菌清透又能疏散人参壅补酿生之内热，使整体药性趋于平和^[10]。

CD69是一种重要的细胞表面标志物，又被称为活化诱导分子。CD69在静息状态的免疫细胞中几乎不表达，在免疫细胞受到刺激后快速表达上调^[11]，并可通过与S1PR1相互作用，抑制淋巴细胞迁出淋巴结，从而调控免疫应答的强度和持续时间^[12]。检测CD69表达可反映免疫细胞的早期活化状态，是评价药物免疫调节活性的常用指标。

目前，关于桦褐孔菌人参复配提取物的制备工艺优化及其免疫调节活性研究尚不充分，特别是对免疫细胞CD69表达的影响未见系统报道。本研究以总多糖提取率为指标，优化桦褐孔菌人参复配粉的提取工艺，测定总多糖提取率，并采用流式细胞术检测桦褐孔菌人参复配粉对小鼠脾脏T细胞、B细胞、自然杀伤（natural killer，NK）细胞及单核细胞CD69表达的调控作用，初步探究其在免疫细胞初始应答层面的作用特征，为桦褐孔菌人参复配粉的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验动物

SPF级雄性C57BL/6小鼠，6～8周龄，体质量18～22 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司[许可证号：SCXK（京）2024-0001]。小鼠饲养于恒温（22±2）℃、恒湿（50±10）%环境下，自由摄食饮水。所有动物实验操作均经过吉林大学动物伦理委员会批准（批准号：20240070），并遵循国家实验动物管理与使用指南。

1.1.2 材料来源

桦褐孔菌药材2025年10月购自抚松县正纯商贸有限公司，人参药材2025年10月购自河北新京源药业。

1.1.3 主要试剂

无水葡萄糖（广东光华科技股份有限公司，1006580-1.18327.010）；硫酸（成都科隆化学品有限公司，1007186-AR）；蒽酮（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，A#A108571）；香草醛（安徽泽升科技有限公司，JT-011004-E120257000）；冰醋酸（广东光华科技股份有限公司，1006546-1.14100.058）；甲醇（安徽泽升科技有限公司，1001522-A040901）；正丁醇（广东光华科技股份有限公司，1006615-1.17030.023）；RPMI-1640基础培养基（Sigma-Aldrich，BC-M-017-500 mL）；胎牛血清（南京森贝伽生物科技有限公司，BC-SE-FBS07-500 mL）；磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）（Sigma-Aldrich，C3580-0500）；红细胞裂解液（北京索莱宝科技有限公司；R1010）；台盼蓝（Merck KGaA，T6146）；Cell Counting Kit-8（CCK-8，Med Chem Express，HY-K0301-5 mL）；流式染色缓冲液（北京索莱宝科技有限公司，CA2490）；PE-CD69抗体（斯达特生物技术有限公司，S0B8593）；FITC-CD4抗体（斯达特生物技术有限公司，S0B5092）；FITC-CD8α抗体（斯达特生物技术有限公司，S0B5120）；FITC-CD19抗体（斯达特生物技术有限公司，S0B1647）；FITC-CD11b抗体（斯达特生物技术有限公司，S0B1808）；APC-CD3抗体（斯达特生物技术有限公司，S0B5819）；APC-Ly-6C抗体（斯达特生物技术有限公司，S0B5971）；Alexa Fluor 647-NK1.1抗体（斯达特生物技术有限公司，S0B5488）。

1.1.4 主要仪器

电水壶（广东美的生活电器制造有限公司，MK-YS17J3-316）；真空减压干燥箱（上海博讯医疗生物仪器股份有限公司，BZF-50）；酶标仪（安捷伦生物有限公司，BioTek Synergy H1）；电热恒温水浴锅（杭州聚同电子有限公司，JTDC-0506）；CO₂培养箱（Thermo Fisher Scientific，371）；流式细胞仪（安捷伦生物有限公司，NovoCyte 2000R）；精密天平（奥豪斯仪器有限公司，PR124ZH）；血球细胞计数板（Paul Marienfeld GmbH & Co. KG，0640110）；医用离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司，JW-2019HR）。

1.2 桦褐孔菌人参复配粉提取工艺优化

1.2.1 交互作用试验设计

根据《食品安全地方标准桦褐孔菌》（DBS22/034-2022）^[13]及《中华人民共和国药典》^[14]对桦褐孔菌和人参用法用量的规定，并结合文献报道中二者发挥免疫调节作用的有效剂量，确定桦褐孔菌人参复配粉的拟定配方（每日食用量）为：人参2.5 g，桦褐孔菌5 g。为满足后续实验需求，提取工艺优化实验将拟定配方等比放大，保持两者配比不变，故选取15 g人参、30 g桦褐孔菌作为提取方案的剂量。由于提取所用水量（因素A）、提取时间（因素B）及提取次数（因素C）对提取效率的影响较大，因此选择该因素设计交互作用试验，同时选择固定3组不同的水用量与提取时间、不固定提取次数，按表1的要求进行提取，提取液在40℃ 1 kPa条件下真空减压干燥，以总多糖提取率为评价指标优选提取工艺。

1.2.2 多糖含量测定

使用硫酸蒽酮法测定多糖含量，以葡萄糖标准品溶液作标准曲线。标准曲线方程为Y=0.7871X+0.0004，R²=0.9501（n = 6）。取水提物粉末约0.5 g，热水溶解后，加入乙醇至终浓度为70%，4℃摇匀12 h，离心，弃上清。沉淀用热水溶解至50 mL，摇匀，离心，精密量取上清液700 μL，加水至2 mL，摇匀，即得供试品溶液。取1 mL供试品溶液，加入硫酸蒽酮溶液3 mL，摇匀，放置15 min后冰浴15 min，在625 nm波长处测定吸光度。

1.2.3 验证实验

按确定的最佳工艺条件重复提取3次，测定总多糖提取率，验证工艺稳定性。

1.3 桦褐孔菌人参复配粉对小鼠脾细胞CD69表达的影响

1.3.1 脾细胞悬液制备

取6～8周龄C57BL/6小鼠，无菌采集脾细胞悬液，过滤，加入红细胞裂解液，静置5 min，加入含2%胎牛血清的PBS终止裂解，离心，弃上清，加入PBS重悬，过滤。取10 μL细胞悬液稀释，计数。剩余细胞悬液离心后弃上清，加入适量培养基重悬，备用。

1.3.2 CCK-8法检测脾细胞活力

设置复配粉浓度梯度0、6.25、12.5、25、50、100、200 μg·mL^-1，每个浓度设3个复孔。取脾细胞悬液接种于96孔板，每孔100 μL。随后每孔加入100 μL含相应浓度复配粉的培养基，每孔终体积为200 μL，37℃、5% CO₂培养箱培养24 h。每孔加入CCK-8试剂20 μL，继续培养4 h，450 nm下测定光密度（optical density，OD）值，计算细胞活力。细胞活力（%）=（实验组_OD-实验空白组_OD）/（对照组_OD-空白组_OD）×100%。

1.3.3 CD69表达检测

称取适量桦褐孔菌人参复配粉，用RPMI-1640完全培养基溶解，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，备用。设置未染色对照、单染对照、阴性对照、刀豆蛋白A（Concanavalin A，ConA）组（2.5 μg·mL^-1）、荧光减一（fluorescence minus one，FMO）对照组和桦褐孔菌人参复配粉组（100 μg·mL^-1）。将分离C57BL/6小鼠脾淋巴细胞，调整细胞密度至每毫升2×10⁶个，悬液接种入6孔板，随即各组加入相应的含药培养基，各孔终体积3 mL，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养24 h。培养结束后，收集细胞，离心，弃上清，加入适量染色缓冲液重悬细胞，计数，加入Fc受体阻断剂，室温孵育10 min。依据检测细胞亚群加入相应荧光抗体，冰上避光孵育20 min。孵育结束后，染色缓冲液洗涤2次，重悬细胞，备检。采用NovoExpress软件进行数据分析。设门策略如下：先通过前向散射光（forward scatter，FSC）/侧向散射光（side scatter，SSC）设门圈定淋巴细胞，依次圈定CD4⁺ T细胞（CD3⁺，CD4⁺）、CD8⁺ T细胞（CD3⁺，CD8α⁺）、B细胞（CD19⁺）、NK细胞（NK1.1⁺）和单核细胞（CD11b⁺，Ly-6C⁺）。针对每个亚群，以相应FMO对照管设定阳性门，计算PE-CD69阳性细胞百分比。

1.4 统计学方法

交互作用试验和CCK-8试验结果使用Graphpad Prism软件进行分析，流式细胞术实验使用NovoExpress软件和Graphpad Prism软件进行分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 交互作用试验结果

以总多糖提取率为指标，利用交互作用试验优化桦褐孔菌人参提取工艺参数，结果见表2、表3。由表可得，交互作用因素的离差平方和比较，因素C对提取率影响较大。K值越大表明某因素在某水平下效果越好，仅从各因子最佳水平组合考虑，工艺A₂B₂C₃为最优。实验数据表明，工艺A₂B₂C₃的多糖提取率仅为1.306%，而工艺A₁B₁C₃的多糖提取率为1.829%。图1表现了不同因素A-B组合下，总多糖提取率随因素C的变化趋势。由图1可见，因素A₁B₁组合随因素C水平上升，多糖提取率急剧上升，A₂B₂则趋于平缓，A₃B₃增幅居中，提示因素C与因素A-B存在交互作用。因此，本实验基于实测多糖提取率与交互作用图所反映的实际趋势，确定最优工艺条件为A₁B₁C₃，并进行验证试验。3次验证试验结果见表4，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）值为3.35%，优化工艺稳定可靠。

2.2 桦褐孔菌人参复配粉对小鼠脾细胞CD69表达的影响

2.2.1 CCK-8实验结果

CCK-8法检测不同浓度复配粉处理24 h后脾细胞存活率，结果见表5、图2。与0 μg·mL^-1相比，桦褐孔菌人参复配粉有效提升脾细胞活力，当浓度达到100 μg·mL^-1时作用最强，细胞活力达到190.01%±11.95%（P＜0.000 1），因此，选择100 μg·mL^-1作为后续实验浓度。

2.2.2 流式细胞术结果

流式细胞术检测桦褐孔菌人参复配粉对小鼠脾脏不同免疫细胞亚群早期活化标志物CD69表达的影响，结果见图3、图4、图5、图6、图7。

3 讨论

桦褐孔菌营养丰富，含有多种生物活性成分，具有免疫调节、降血糖等功能。人参大补元气，具有广泛的药理活性。本研究设计交互作用试验，综合考虑溶剂用量、提取时间、提取次数三因素，以总多糖提取率为指标，筛选桦褐孔菌人参复配粉提取的最佳工艺。CCK-8结果显示，桦褐孔菌人参复配粉可刺激小鼠脾细胞增殖，提示其具有潜在的免疫调节活性。

为进一步验证桦褐孔菌人参复配粉对脾细胞的活化作用，本研究运用流式细胞术检测小鼠脾细胞各细胞亚群CD69表达。结果显示，复配粉能够显著上调NK细胞、巡逻单核细胞和炎性单核细胞CD69表达，上调幅度均达到ConA组的75%以上，而CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞、B细胞CD69表达仅轻微升高，远低于ConA组。NK细胞和单核细胞均属于固有免疫系统的核心效应细胞。NK细胞能够直接杀伤病毒感染细胞和肿瘤细胞，同时调节免疫平衡。单核细胞在组织中分化为巨噬细胞或树突状细胞，在识别病原体、加工并提呈抗原、启动T细胞活化中扮演重要角色^[15]。实验结果提示桦褐孔菌人参复配粉可能是作用于固有免疫系统的潜在免疫激活剂。桦褐孔菌人参复配粉主要有效成分为多糖，多糖已被广泛报道具有免疫调节活性。例如，阿魏菇多糖、姬松茸多糖等真菌多糖能够促进小鼠脾细胞增殖^[16-17]，人参多糖能够刺激NK细胞分泌干扰素-γ（interferon-gamma，IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor-alpha，TNF-α）等多种细胞因子^[18]。研究^[19-20]证实，固有免疫细胞表面高表达多种模式识别受体，包括识别多糖特征结构的Dectin-1等C型凝集素受体，以及TLR2、TLR4等Toll样受体。在机制上，多糖可通过这些受体发挥活性，例如香杏丽蘑多糖能够通过结合TLR4，激活NF-κB信号通路，促使巨噬细胞分泌促炎因子，发挥免疫刺激活性^[21]。因此，桦褐孔菌人参复配粉可能通过其有效成分多糖与固有免疫细胞模式识别受体相互作用，激活固有免疫应答，进而发挥免疫调节作用，其具体分子机制有待进一步研究。

4 结论

本研究通过交互作用实验优化桦褐孔菌人参复配粉的提取工艺，确定最佳提取条件，所获得的提取物在体外能显著促进小鼠原代脾细胞增殖，并可上调脾脏NK细胞和单核细胞表面早期活化标志物CD69的表达。本研究为桦褐孔菌人参复配粉作为潜在免疫调节功能食品的开发提供了科学依据。

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基金资助

吉林省科技厅医药健康处项目(20240401052YY)