人线粒体DNA聚合酶γ表达纯化及活性分析

摘要

目的 表达纯化人线粒体DNA聚合酶γ（Pol γ），并分析其活性，以应用于核苷（酸）类抗病毒药的毒副作用检测与筛选。方法 以质粒PCMV-SPORT6-POLG为模板，PCR扩增人线粒体DNA聚合酶γ基因（POLG），并克隆至pPIC9K载体中，构建高效表达载体pPIC9K-POLG，重组表达载体经酶切线性化后采用电击转化法转化GS115毕赤酵母细胞，30℃ 1%甲醇诱导表达。表达蛋白经SDS-PAGE和Western Blot鉴定和纯化，并利用掺入法对比商品Pol γ酶分析其活性。结果 PCR扩增的POLG基因大小约3.7 kb，测序分析结果与Gen Bank 中公布的序列一致，表达的Pol γ重组蛋白为可溶性蛋白，其分子量约为138 KD，重组Pol γ酶具有比商品酶略低的活性。结论 构建了重组高效表达载体pPIC9K-POLG，成功在酵母细胞中表达了重组Pol γ酶，建立了Pol γ酶的体外真核表达体系。重组酶活力约为8 U·μL^-1，可应用于核苷（酸）类抗病毒药物的筛选和检测。

关键词

人线粒体DNA聚合酶γ / GS115毕赤酵母 / 表达纯化 / 活性分析