基于GSH/GPX4/ROS通路探讨独活寄生汤抑制软骨细胞铁死亡的机制研究

摘要

目的 基于GSH/GPX4/ROS通路探讨独活寄生汤抑制erastin诱导软骨细胞铁死亡的机制。方法 选择4周龄SPF级雄性SD大鼠30只，采用机械-Ⅱ型胶原酶消化法提取大鼠原代软骨细胞进行体外培养。软骨细胞随机分为对照组、模型组、独活寄生汤组、Fer-1组，对照组用正常培养基培养；模型组用含1μmol/Lerastin的培养基培养；独活寄生汤组用含1μmol/L erastin和300μg/mL独活寄生汤培养基培养；Fer-1组用含1μmol/L erastin和1μmol/L Ferrostatin-1培养基培养，每组干预24 h。干预后，采用透射电镜观察各组软骨细胞超微结构；采用比色法检测细胞内丙二醛（MDA）含量；采用微量法检测铁离子(Fe²⁺)含量；采用微板法检测谷胱甘肽（GSH）含量；采用Western blot检测谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、溶质载体家族7成员11（SLC7A11）和酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）蛋白表达水平；采用荧光显微镜观察细胞内GPX4蛋白表达水平；采用荧光探针检测法观察细胞内ROS和脂质过氧化水平。结果 （1）软骨细胞超微结构：与对照组比较，模型组线粒体嵴减少甚至消失，线粒体外膜破裂。与模型组比较，独活寄生汤组线粒体膜相对完整，线粒体变窄，嵴数量增加。（2） MDA、Fe²⁺、GSH含量：与对照组比较，模型组MDA、Fe²⁺含量均明显升高（P<0.05）,GSH含量明显降低（P<0.05）；与模型组比较，独活寄生汤组和Fer-1组MDA、Fe²⁺含量均明显降低（P<0.05）,GSH含量均明显升高（P<0.05）。（3）软骨细胞铁死亡相关蛋白表达水平：与对照组比较，模型组GPX4、SLC7A11蛋白表达水平明显降低，ACSL4蛋白表达水平明显上升，GPX4蛋白荧光表达量明显降低，差异均具有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，独活寄生汤组GPX4、SLC7A11蛋白表达水平均明显上升（P<0.05）,Fer-1组GPX4、SLC7A11蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05），独活寄生汤组、Fer-1组ACSL4蛋白表达水平明显降低，GPX4蛋白荧光表达量明显增加，差异均具有统计学意义（P<0.05）。（4）细胞内ROS和脂质过氧化水平：与对照组比较，模型组细胞内ROS和脂质过氧化水平明显上升（P<0.05）；与模型组比较，独活寄生汤组和Fer-1组细胞内ROS和脂质过氧化水平均明显下降（P<0.05）。结论 独活寄生汤可抑制erastin诱导的软骨细胞铁死亡，其机制可能与调节GSH/GPX4/ROS通路有关。

关键词

骨关节炎 / 软骨细胞 / 铁死亡 / GSH/GPX4/ROS通路 / 独活寄生汤

基金资助

国家自然科学基金项目(82074461); 福建省自然科学基金项目(2021J011258); 福建中医药大学校管课题(XB2022141)