基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路探讨健骨颗粒对UMR-106细胞内质网应激凋亡的影响

摘要

目的 探讨健骨颗粒含药血清对UMR-106成骨样细胞内质网应激ERS凋亡的影响和作用机制。方法 选用UMR-106成骨样细胞，采用0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05μmol/L不同浓度的GSK2606414（PERK抑制剂）对细胞进行干预，采用CCK8法筛选GSK2606414最佳干预浓度。将生长状态较好的UMR-106细胞随机分为阴性对照组（NC组）、模型组（H₂O₂组）、健骨颗粒组（H₂O₂+JG组）和阳性对照组（H₂O₂+GSK2606414组）4组。NC组和H₂O₂组采用10%生理盐水血清干预12 h,H₂O₂+JG组采用10%健骨颗粒含药血清干预12 h,H₂O₂+GSK2606414组采用0.03μmol/L的GSK2606414和10%生理盐水血清干预12 h，除NC组外，其余各组在不更换新培养基的情况下，再分别加入10μmol/L H₂O₂干预12 h。采用激光共聚焦显微镜观察细胞内NC组和H₂O₂组GRP78和Caspase-12荧光表达情况，DCFH-DA检测活性氧（ROS）含量，激光共聚焦显微镜观察细胞内钙离子实时动态变化判断ROS/ERS模型是否成立。再采用Annexin V-FITC/PI检测4组细胞晚期凋亡率，qPCR和Western blot检测4组ERS相关标志指标GRP78、PERK、eIf2α、ATF4和CHOP mRNA转录水平和蛋白相对表达量。结果与0μmol/L组比较，0.03μmol/L的GSK2606414是干预UMR-106细胞12 h后对细胞活力没有影响的最大浓度，故使用该浓度作为后续H₂O₂+GSK2606414组的实验干预条件。与NC组相比，H₂O₂组ROS含量显著增高（P<0.01）,GRP78和Caspase-12的蛋白荧光表达量明显增加，细胞内钙离子流动速度加快并持续增高，表明H₂O₂诱导UMR-106细胞ROS/ERS模型的成功建立。与NC组相比，H₂O₂组凋亡率显著增高（P<0.05）,GRP78、PERK、eIf2α、ATF4、CHOP mRNA转录水平和蛋白相对表达量均显著增高（P<0.01）。与H₂O₂组相比，H₂O₂+JG组和H₂O₂+GSK2606414组ROS含量显著降低（P<0.01），凋亡率显著降低（P<0.05）,GRP78、PERK、eIf2α、ATF4、CHOP mRNA转录水平（P<0.05）和蛋白相对表达量（P<0.01）均显著降低。结论 健骨颗粒可通过PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路缓解内质网过度应激，降低成骨细胞凋亡率，发挥防治绝经后骨质疏松症的作用。

关键词

绝经后骨质疏松症 / 内质网应激 / 健骨颗粒 / PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路 / 成骨细胞凋亡