柚皮苷调控lncRNA GAS5改善骨关节炎软骨细胞线粒体凋亡

摘要

目的 基于lncRNA GAS5探讨柚皮苷抑制软骨细胞线粒体凋亡改善骨关节炎（OA）的机制研究。方法 体内实验，选择2月龄SD雄性大鼠30只，并采用随机数字法将其分为假手术组、模型组和柚皮苷组，每组10只。模型组和柚皮苷组采用改良的Hulth法构建大鼠OA模型，假手术组大鼠在相同位置仅打开关节腔，随即缝合伤口。术后4周，柚皮苷组采用75 mg/kg柚皮苷溶液进行灌胃，假手术组和模型组给予等量生理盐水，每周灌胃6次，连续灌胃4周。采用甲苯胺蓝和番红O染色分析观察大鼠关节软骨组织病理切片的形态变化；qPCR和Western blot法检测大鼠关节软骨组织中lncRNA GAS5表达水平及Caspase-3、Bax、MMP-13和Cyt-C蛋白表达量；TUNEL法检测柚皮苷对大鼠软骨组织中软骨细胞凋亡率的影响。体外实验，(1)将细胞随机分为空白组、SNP组、柚皮苷组和SNP+柚皮苷组4组，采用荧光原位杂交（FISH）法检测各组lncRNA GAS5的表达量。(2)将细胞随机分为空白+sh-NC组、SNP+sh-NC组、空白+sh-GAS5组和SNP+sh-GAS5组4组，采用qPCR法检测各组lncRNA GAS5表达水平。(3)将细胞分为空白组、SNP+柚皮苷组、SNP组和SNP+柚皮苷+sh-GAS5组4组，采用Western blot法检测各组Caspase-3、Bax、MMP-13和Cyt-C的蛋白表达量。结果 (1)体内实验结果：甲苯胺蓝和番红O染色结果显示，假手术组膝关节软骨层展现出清晰的层次结构，表面光滑完整，软骨细胞排列整齐有序，潮线清晰可见；模型组膝关节软骨层表面粗糙不平，存在明显缺损，结构变得模糊不清，并可见到空洞；与模型组比较，柚皮苷组软骨表面相对光滑，软骨细胞排列更加整齐，潮线保持完整，软骨染色呈现出更为均匀的状态。qPCR结果显示，与假手术组比较，模型组lncRNA GAS5表达水平升高（P<0.05）；与模型组比较，柚皮苷组lncRNA GAS5表达水平下降（P<0.05）。Western blot结果显示，与假手术组比较，模型组Caspase-3、Bax、MMP-13和Cyt-C的蛋白表达量升高（P<0.05）；与模型组比较，柚皮苷组Caspase-3、Bax、MMP-13和Cyt-C的蛋白表达量降低（P<0.05）。TUNEL法检测结果显示，与假手术组比较，模型组软骨细胞凋亡率增加（P<0.05）；与模型组相比，柚皮苷组软骨细胞凋亡率减少（P<0.05）。(2)体外实验结果：FISH结果显示，与空白组比较，SNP组软骨细胞中lncRNA GAS5荧光表达量增加（P<0.05）；与SNP组比较，SNP+柚皮苷组lncRNA GAS5荧光表达量减少（P<0.05）。qPCR结果显示，与空白+sh-NC组比较，SNP+sh-NC组的lncRNA GAS5 mRNA表达水平明显升高（P<0.05）；与空白+sh-NC组比较，空白+sh-GAS5组的lncRNA GAS5 mRNA水平明显下降（P<0.05），证明sh-GAS5转染成功；与SNP+sh-NC组比较，SNP+sh-GAS5组的lncRNA GAS5 mRNA相对表达量降低（P<0.05）。Western blot结果显示，与空白组比较，SNP组的Caspase-3、Bax、MMP-13和Cyt-C蛋白表达量升高（P<0.05）；与SNP组比较，SNP+柚皮苷组Caspase-3、Bax、MMP-13和Cyt-C蛋白表达量下降（P<0.05）；与SNP+柚皮苷组比较，SNP+柚皮苷组+sh-GAS5组Caspase-3、Bax、MMP-13和Cyt-C蛋白表达量上升（P<0.05）。结论 柚皮苷可通过抑制lncRNA GAS5表达，减少软骨细胞线粒体凋亡，延缓软骨退变进程，改善OA。

关键词

骨关节炎 / 线粒体凋亡 / 柚皮苷 / 长链非编码RNA生长停滞特异性5(lncRNA GAS5) / 软骨细胞

基金资助

国家自然科学基金青年科学基金项目(82104888); 福建省自然科学基金项目(2020J01756); 福建中医药大学校管课题(X2023024)