RRM2通过MDM2/P53通路调节肺腺癌细胞凋亡、增殖及耐药的探讨

摘要

目的 本研究旨在深入分析核糖核酸还原酶M2（ribonucleotide reductase M2,RRM2）在肺腺癌中的表达模式及其生物学作用，特别是关注其如何通过鼠双微基因2（murine double minute gene 2,MDM2）/P53信号通路影响肺腺癌细胞的增殖、凋亡以及耐药性的发展。方法 为研究肺腺癌细胞中RRM2基因的表达及其相关机制，选取人肺腺癌细胞系A-427、A549、PC-9和正常人支气管上皮细胞BEAS-2B。利用逆转录聚合酶链反应（RT-polymerase chain reaction, RT-PCR）,筛选出RRM2高表达的肺腺癌细胞系。将PC-9细胞分为si-NC组（作为低表达对照）、oe-NC组（作为高表达对照）、si-RRM2组（RRM2低表达组）和oe-RRM2组（RRM2高表达组）。对这些组别的细胞进行增殖率和凋亡率测定。为深入理解蛋白质之间的相互作用，使用STRING在线分析平台构建蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络，并借助Cytoscape软件对RRM2、MDM2和P53这3个关键蛋白的核心节点进行分析。通过双荧光素酶报告系统，验证RRM2和MDM2、MDM2和P53之间的靶向关系。为进一步探索信号通路，利用KEGG数据库对MDM2和P53信号通路进行富集分析。最后，检测各组细胞的半数抑制浓度(50%inhibiting concentration, IC₅₀)以及RRM2、MDM2、P53、Cyclin D1、Bax、Bcl-2、Caspase3、MRP、MDR1、GST-π等相关蛋白的表达水平。结果 RT-PCR分析表明，与BEAS-2B细胞相比，肺腺癌细胞A-427、A549和PC-9中RRM2 mRNA的相对表达量更高（P<0.05）,其中PC-9细胞展现出最高RRM2表达水平（P<0.05）。因此选择PC-9细胞作为后续实验的研究对象。相较于oe-NC组，oe-RRM2组的细胞展现出明显的增殖率提升和凋亡率下降（P<0.05）。与si-NC组相比，si-RRM2组的细胞增殖率明显降低，凋亡率相应增加（P<0.05）。通过PPI网络分析，发现MDM2在RRM2的核心基因中获得最高评分，而P53在MDM2的核心基因中评分最高。双荧光素酶报告实验结果显示，与oe-NC组相比，oe-RRM2组中的野生型WT-MDM2荧光素酶活性明显提高，差异有统计学意义（P<0.05）。oe-MDM2组中的野生型WT-P53荧光素酶活性明显低于oe-NC组，差异有统计学意义（P<0.05）。通过对MDM2和P53信号通路的富集分析可知，MDM2能够抑制P53的表达，而P53可调控下游P21和Cyclin D1的表达，进而影响Bax和Bcl-2的表达水平。由此，本研究决定将Bax、Bcl-2和Cyclin D1作为后续研究中增殖和凋亡检测的关键蛋白指标。研究结果表明，相较于oe-NC组，oe-RRM2组细胞的IC₅₀值有所上升，同时RRM2、MDM2、Bcl-2、Cyclin D1、MRP、MDR1、GST-π的表达量增加，Bax、Caspase-3、P53的表达量减少。与si-NC组相比，si-RRM2组细胞的IC₅₀值降低，RRM2、MDM2、P53、Cyclin D1、Bax、Bcl-2、Caspase3、MRP、MDR1、GST-π的表达量减少，Bax、Caspase-3、P53的表达量增加。结论 RRM2通过MDM2/P53信号通路调节肺腺癌细胞的增殖、凋亡和耐药性。该研究旨在探究RRM2在肺腺癌中的作用及其作为潜在靶向治疗的可能性。

关键词

核糖核酸还原酶M2 / 鼠双微基因2 / P53 / 肺腺癌 / 凋亡 / 增殖 / 耐药