超声介导脂质微泡的高效骨骼肌基因递送体系用于黑色素瘤的免疫治疗

摘要

目的 建立新型非病毒载体介导的基因递送/表达体系,将活体局部骨骼肌细胞改造成“智能化药物生产工厂”,生产治疗性蛋白类药物,通过血液循环到达并识别其靶点（分子、细胞、器官或组织）,为机体提供持续不断的蛋白类药物供给。方法 首先,将液态全氟己烷（perfluorohexane,PFH）引入脂质体（liposome,Lipo）内形成Lipo-PFH脂质微泡,通过定向超声波调控使PFH发生液-气相变,产生超声靶向微泡破坏（ultrasound-targeted microvesicle destruction,UTMD）效应,将Lipo-PFH脂质微泡搭载的质粒DNA （plasmid DNA,pDNA）高效、安全传递到骨骼肌细胞中进行表达。然后,通过琼脂糖凝胶电泳探究Lipo和pDNA在不同质量比条件下的结合情况;采用人胚肾细胞HEK-293T和小鼠成肌细胞C2C12评估Lipo-PFH的细胞毒性;采用琼脂糖凝胶孔洞模型研究超声波引发Lipo-PFH发生相变的情况;利用表达报告基因的质粒pLuc进行体内基因递送效率的优化。最后,利用表达免疫检查点抑制剂的功能质粒（基因药物,pα-PD-1和pα-CTLA-4）对黑色素瘤荷瘤小鼠进行治疗,评估治疗效果。结果 （1）Lipo平均粒径和Zeta电位分别为13 9.4 nm和33.1 mV;Lipo-PFH平均粒径和Zeta电位分别为261.6 nm和39.6 mV。琼脂糖凝胶电泳筛选出最佳的复合质量比为7:1,并通过Zeta电位分析进行证实。（2）Lipo-PFH浓度增加到50%,细胞活力依然保持在90%左右。（3）体外条件下证实温度60℃或超声功率2 W/cm²、时间2 min可引发Lipo-PFH中的PFH产生液-气相变,进而在体内条件下优化超声功率和时间对Lipo-PFH中PFH相变的影响。（4）以2 W/cm²、3 min超声21 d仍可检测到荧光素酶表达信号。治疗组小鼠肿瘤生长缓慢（24d内均维持在100 mm³左右）,肿瘤质量最小,小鼠生存率最高,瘤内浸润的CD8⁺T细胞比例显著增加。治疗20 d后,病理学分析显示各组小鼠心、肝、脾、肺、肾和肌肉等均未见病理改变。结论 利用脂质微泡技术,将表达PD-1和CTLA-4抗体的质粒高效递送到黑色素瘤小鼠骨骼肌细胞中,为自体持续生产、供给抗体药物,可安全有效地控制黑色素瘤的生长。

关键词

脂质微泡 / 超声靶向微泡破坏 / 原位基因递送 / 基因药物 / 免疫治疗 / 黑色素瘤