血根碱通过激活LKB1/AMPK/SIRT1通路抑制内质网应激和细胞衰老以改善骨关节炎

摘要

目的 研究血根碱（sanguinarine,SG）在骨关节炎（osteoarthritis,OA）进展中的作用，并探讨其可能机制。方法 分离原代小鼠膝关节软骨细胞，分为SG、叔丁基过氧化氢（tert-butyl hydroperoxide,TBHP）、TBHP+SG、TBHP+SG+毒胡萝卜素（thapsigargin,TG）、TBHP+SG+肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)siRNA组。利用CCK-8、流式细胞术、DCFH-DA探针、β针半乳糖苷酶（β-galactosidase,β-gal）染色分别检测细胞活力、凋亡、活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平和β-gal活性。利用RT-qPCR和Western blotting检测衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype,SASP）的mRNA水平和LKB1/AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）/去乙酰化酶1(sirtuin 1,SIRT1)通路相关蛋白表达。将小鼠分为Sham、Sham+SG(1.25μM,10μL)、OA、OA+SG(0.8/1.25μM,10μL)组，利用番红O-固绿和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling,TUNEL）染色评估软骨丢失和凋亡情况。结果 浓度筛选显示SG处理软骨细胞的最适浓度为1.25μM。SG处理可逆转TBHP诱导的细胞活力下降，细胞凋亡、细胞外基质（extracellular matrix,ECM）降解、ROS生成、衰老相关蛋白[如细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(cyclin dependent kinase inhibitor 1A,p21)和周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(cyclin dependent kinase inhibitor 2A,p16)]表达、SASP[如单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、基质金属蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3,MMP3)、C-X-C基序趋化因子配体10(C-X-C motif chemokine ligand 10,Cxcl10)]mRNA表达以及β-gal活性升高。TG处理可逆转上述改变。SG处理有效中和TBHP诱导的内质网（endoplasmic reticulum,ER）应激相关蛋白[如葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78 kD, GRP78)和C/EBP同源蛋白（C/EBP Homologous Protein,CHOP）]表达上调以及LKB1和AMPK磷酸化水平和SIRT1蛋白水平降低。沉默LKB1可抵抗SG对ER应激的抑制作用，表明SG通过调控LKB1/AMPK/SIRT1通路抑制TBHP诱导的ER应激。在体内，SG以剂量依赖方式减轻OA小鼠的软骨细胞凋亡和软骨丢失。结论 血根碱通过激活LKB1/AMPK/SIRT1信号通路抑制ER应激，从而缓解氧化应激诱导的软骨细胞ECM降解、凋亡和衰老，阻碍小鼠OA进展，为OA治疗提供了新的理论依据。

关键词

血根碱 / LKB1/AMPK/SIRT1通路 / ER应激 / 衰老 / 软骨细胞