多房棘球蚴增殖细胞核抗原基因序列分析、原核产物鉴定及亲和力检测

生鸿鹏; 蔺小奇; 王帅; 李慧敏; 何佳欣; 罗丽; 蒋佳颖

doi:10.13452/j.cnki.jqmc.2026.03.004

中国高原医学与生物学杂志 ›› 2026, Vol. 47 ›› Issue (3) : 174 -181. DOI: 10.13452/j.cnki.jqmc.2026.03.004

多房棘球蚴增殖细胞核抗原基因序列分析、原核产物鉴定及亲和力检测

生鸿鹏, 蔺小奇, 王帅, 李慧敏, 何佳欣, 罗丽, 蒋佳颖

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摘要

目的分析多房棘球蚴（echinococcus multilocularis,Em）增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）基因序列，鉴定原核产物，检测Em-PCNA重组蛋白与AOH1996的亲和力。方法使用TMHMM、SOPMA等生信网站分析Em-PCNA基因序列。提取多房棘球蚴总RNA，经反转录合成cDNA，通过PCR技术对Em-PCNA基因进行特异性扩增，将成功扩增的Em-PCNA基因克隆至pET28a（+）载体上，并进一步转化至大肠埃希菌Rosetta（DE3）进行Em-PCNA基因片段蛋白的原核表达，将异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）作为诱导剂，采用Ni-NTA亲和层析技术进行纯化，采用SDS-PAGE、Western Blot法进行鉴定。通过微量热泳动（MST）法检测Em-PCNA重组蛋白与AOH1996的亲和力。结果基因序列分析表明，Em-PCNA含260个氨基酸，等电点为5.71；蛋白结构分析显示，Em-PCNA具有PCNA超家族结构与保守功能结构域；系统进化分析显示，Em-PCNA与带科绦虫聚于一类，与人和犬、牛、旋毛虫亲缘关系较远。将构建的原核表达载体pET28a-Em-PCNA转化为Rosetta（DE3）后，经IPTG诱导，成功表达EmPCNA重组蛋白，且以可溶性形式表达，分子量约为36 ku，与理论分子量大小基本一致。分子对接结果显示，Em-PCNA与AOH1996的最低结合能为-6.20 kcal·mol^-1，结合氢键键长为2.6Å；Em-PCNA重组蛋白与AOH1996结合的解离常数（Kd）为（37.55±4.69）nM。结论明确了EmPCNA基因序列，有效鉴定了原核产物，得出了Em-PCNA重组蛋白与AOH1996具有较强亲和力的结论。