基于食管上皮Trp53敲除和Ccnd1过表达的食管癌自发成瘤小鼠模型的构建

摘要

目的 利用Cre-loxP系统和CRISPR/Cas9技术构建Trp53基因敲除和Ccnd1过表达的小鼠食管癌模型。方法 针对C57BL/6小鼠Trp53基因外显子2-9,设计RNA靶位点并在体外转录获得sgRNA,与编码Cas9的mRNA混合后通过受精卵显微注射方法获得F0代小鼠，繁育得到Trp53^fl/fl小鼠。同时针对C57BL/6小鼠基于Cre-loxP系统在其安全位点设计鼠Ccnd1基因条件性过表达(Ccnd1^{R26-LSL-mcherry})小鼠。用Trp53^fl/fl小鼠、Ccnd1^{R26-LSL-mcherry}小鼠和带有EDL2-Cre小鼠进行交配繁殖，收集小鼠尾部组织提取DNA,利用PCR技术和琼脂糖凝胶电泳对其子代进行基因型鉴定，验证基因在小鼠的表达情况，得到目标小鼠，即食管上皮Trp53基因敲除Ccnd1过表达小鼠(Trp53^fl/fl;Ccnd1^{R26-LSL-mcherry};EDL2-Cre小鼠，简写为Trp53^fl/fl;Ccnd1^cKI/cKI;EDL2-Cre鼠),并命名为CP鼠。提取CP小鼠食管组织蛋白，用Western blot检测Trp53蛋白和Ccnd1蛋白的表达水平；记录CP小鼠的体重，并与野生型小鼠比较；取不同生长时期的小鼠，行苏木精-伊红（HE）染色观察小鼠食管组织的形态结构。结果 根据鼠尾提取的DNA用PCR技术能鉴定出小鼠的基因型，成功繁育出CP小鼠，该小鼠可正常生长，体质量与野生型小鼠无明显差异（P>0.05）,状态良好，饮食饮水正常。根据小鼠食管切片HE染色统计结果显示，在12月龄，食管癌发生率可达28%,可用于后期研究。结论 成功构建的CP鼠可在正常生长过程中出现食管上皮特异性癌变，将为探索食管癌的生理病理作用机制及免疫微环境对肿瘤的影响提供在体模型。

关键词

食管癌 / Cre-loxP系统 / CRISPR/Cas9技术 / 小鼠模型

基金资助

河南省优秀青年科学基金(222300420041); 河南省重点研发与推广专项(科技攻关)项目(242102310146)