ralb34k2-1刺激小鼠RAW264.7巨噬细胞对蛋白质PTM代谢物修饰及DENV-2易感性的影响

摘要

目的 探讨白纹伊蚊唾液蛋白34k2-1(ralb34k2-1)刺激的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7细胞)胞内蛋白翻译后代谢修饰(PTMs)的变化及对2型登革病毒(DENV-2)易感性的影响。方法 利用抗乙酰化、乳酰化、琥珀酰化、巴豆酰化和丙二酰化的泛特异性抗体，通过免疫印迹法(Western blot)检测ralb34k2-1蛋白刺激后不同时相的RAW264.7细胞蛋白质翻译后代谢物修饰的情况，酶联免疫吸附双抗体夹心法(ELISA)检测细胞内外的乳酸含量；用2 mg/L ralb34k2-1预处理RAW264.7细胞24 h后、继续培养2 d、再用DENV-2感染细胞，通过实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(RT-qPCR)检测感染18 h和36 h后的病毒核酸变化，分析ralb34k2-1预处理后对病毒易感性的影响；检测感染前后胞内白细胞介素1β-(IL-1β)、白细胞介素10-(IL-10)、肿瘤坏死因子β-(TGF-β)、诱导性一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶1(Arg-1) mRNA的相对表达情况，分析ralb34k2-1预处理对细胞免疫状态及细胞极化的影响。结果 胞内不同的代谢物对蛋白质的修饰程度主要表现为乳酰化修饰>乙酰化修饰>琥珀酰化修饰；在时相上，除琥珀酰修饰外，随时间的延长其余代谢物对蛋白质的修饰有增多的趋势，其中以6 h乳酰化修饰最多；ralb34k2-1刺激对细胞的乳酸产生无明显影响；经ralb34k2-1预处理后胞内DENV-E相对表达量较对照组高5倍以上，IL-10 mRNA的相对表达在感染前后均保持高水平(6～8倍);在感染前iNOS/Arg比值为3.46±1.59,但受ralb34k2蛋白预处理的细胞在感染后表现iNOS表达下调的趋势。结论 蚊唾液ralb34k2蛋白可能通过调控PTM代谢物修饰的方式，改变细胞的免疫状态从而增强登革病毒的易感性。

关键词

白纹伊蚊 / 蚊唾液蛋白34k2-1 / 巨噬细胞 / RAW264.7细胞 / 蛋白翻译后修饰 / 2型登革病毒 / 免疫调控