炎症应答中去泛素化酶圆柱瘤蛋白相互作用分子筛选和验证

摘要

目的 筛选炎症应答中与去泛素化酶圆柱瘤蛋白(CYLD)相互作用分子，探究并验证CYLD和参与NF-κB信号通路调节的桥梁蛋白14-3-3家族分子之间是否在细胞内存在相互作用。方法 通过免疫共沉淀(Co-IP)-飞行质谱筛选可能与CYLD相互作用分子，在不同的刺激条件下诱导骨髓原代巨噬细胞向M1和M2极化，利用qRT-PCR、Western blotting技术检测CYLD及可能相互作用的候选分子14-3-3在巨噬细胞内的表达水平。结果 CYLD抗体可以捕获14-3-3蛋白全部的7种亚型(β、γ、ε、η、ζ、δ、θ),提示CYLD很可能与14-3-3蛋白存在相互作用，选取质谱结果中得到特异性肽段最多的3种14-3-3亚型γ、ε、η(14-3-3γ/ε/η),检测结果显示在M0、M1、M2型巨噬细胞中CYLD和14-3-3γ/ε/η均有表达。构建了Myc-CYLD和Flag-14-3-3γ/ε/η真核过表达载体，用Flag抗体成功沉淀出CYLD蛋白，Co-IP结果提示CYLD和14-3-3γ/ε/η三种亚型均存在相互作用。免疫荧光实验显示CYLD和14-3-3在巨噬细胞内存在共定位现象。结论 巨噬细胞炎症应答中CYLD和14-3-3γ/ε/η三种亚型可能存在物理上的相互作用。

关键词

巨噬细胞 / 圆柱瘤蛋白 / 14-3-3亚型 / 炎症应答