基于Keap1/Nrf2/HO‑1信号轴探讨“治神调髓”针刺改善缺血性脑卒中大鼠氧化应激损伤的作用机制

Mechanism of "Zhishen Tiaosui" acupuncture on improving oxidative stress injury in rats with ischemic stroke based on the Keap1/Nrf2/HO‑1 signaling axis

摘要

目的 探讨“治神调髓”针刺通过Keap1/Nrf2/HO‑1信号轴，改善缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）大鼠氧化应激损伤的作用机制。 方法 选用90只SPF级6~8周龄（180~220 g）雄性SD大鼠，设立假手术组、模型组、普通针刺组、“治神调髓”针刺组、西药组（依达拉奉右莰醇组），采用改良线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，采用Zea‑longa神经功能评分方法评估神经功能缺损，TTC检测脑梗死面积，H&E染色观察脑组织病理损伤，尼氏染色检测脑组织病理改变，透射电镜观察缺血脑组织神经元超微结构及线粒体形态，ELISA检测血清中总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T‑SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH‑PX）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量，Western blot检测脑组织Keap1、Nrf2、HO‑1蛋白表达水平。 结果 与模型组相比，“治神调髓”针刺组大鼠神经功能明显改善，梗死面积减少；神经元损伤减轻；尼氏体数量增多，超微结构改善；血清中T‑SOD、GSH‑PX升高（P<0.01），MDA、ROS含量降低（P<0.01），脑组织Keap1蛋白表达水平降低（P<0.01），Nrf2、HO‑1蛋白表达水平升高（P<0.01）。 结论 “治神调髓”针刺可能通过Keap1/Nrf2/HO‑1信号轴，有效减轻IS大鼠的氧化应激损伤，治疗效果与依达拉奉右莰醇相当，明显优于普通针刺，为临床提供了一种非药物的有效替代方案。

Abstract

Objective To investigate the mechanism of "Zhishen Tiaosui" acupuncture improving oxidative stress injury in rats with ischemic stroke （IS） through the Keap1/Nrf2/HO‑1 signaling axis. Methods A total of 90 SPF male SD rats aged 6‒8 weeks （180‒220 g） were selected and divided into the sham operation group， the model group， the conventional acupuncture group， the "Zhishen Tiaosui" acupuncture group， and the Western medicine group （edaravone dexborneol group）， the middle cerebral artery occlusion （MCAO） model by modified suture method were established， the neurological deficit score was evaluated by Zea‑Longa neurological deficit score method， the cerebral infarction area was detected by TTC， the pathological damages of brain tissue were observed by H&E staining， the pathological changes of brain tissue were detected by Nissl staining， and the ultrastructure of ischemic brain tissue neurons， including mitochondrial morphology， was observed by transmission electron microscopy. The contents of total superoxide dismutase （T‑SOD）， malondialdehyde （MDA）， glutathione peroxidase （GSH‑PX）， and reactive oxygen species （ROS） in serum were detected by ELISA. The protein expression levels of Keap1， Nrf2， and HO‑1 in brain tissue were detected by Western blot. Results Compared to the model group， the neurological function of the rats in the "Zhishen Tiaosui" acupuncture group were significantly improved， and the infarct area was reduced. Neuronal damage was alleviated， the number of Nissl bodies was increased， and the ultrastructure was improved. The levels of T‑SOD and GSH‑PX in serum were increased （P<0.01）， the contents of MDA and ROS were decreased （P<0.01）， the expression level of Keap1 protein in brain tissue was decreased （P<0.01）， and the expression levels of Nrf2 and HO‑1 proteins were increased （P<0.01）. Conclusion The "Zhishen Tiaosui" acupuncture may effectively reduce the oxidative stress injury of IS rats through the Keap1/Nrf2/HO‑1 signaling axis. The therapeutic effect is comparable to that of edaravone dexborneol and is significantly better than that of conventional acupuncture. It provides a non‑drug effective alternative for clinical practice.

Graphical abstract

关键词

针刺 / 缺血性脑卒中 / 氧化应激 / 治神调髓

Key words

Acupuncture / Ischemic stroke / Oxidative stress / Zhishen Tiaosui

缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS），又称中风，是一种常见的急性脑血管事件，是脑卒中的主要类型，占比约87%^［1］，主要是由于大脑中动脉阻塞或狭窄，导致脑部缺血、缺氧性坏死的疾病^［2］。大部分卒中幸存者存在肢体偏瘫、认知损伤、运动功能低下、语言和口头交流障碍等神经损伤症状，严重影响其生活质量^［3］，且近年来发病年龄逐渐呈现出年轻化趋势^［4］。现阶段的治疗方式主要有：（1）恢复缺血区血流，如机械取栓、静脉溶栓等；（2）抑制缺血损伤引起的病理生理瀑布式损伤，如神经保护剂治疗^［5］。但是静脉溶栓和手术取栓治疗时间窗短，且存在严重并发症，而神经保护剂治疗临床有效性仍需更多研究支持。针刺作为一种有效的传统中医治疗方式，可以从多方面改变IS造成的损伤，包括促进神经修复与再生、抑制细胞程序性死亡、改善脑循环、调节神经递质活动、抑制炎性反应、减少氧化应激^［6］等。

氧化应激是脑缺血发病机制的中心过程^［7］，Keap1/Nrf2/HO‑1信号轴作为氧化应激的一条经典通路，是细胞抵御氧化应激损伤的核心防御机制，可调控多种抗氧化酶的表达。Nrf2是IS损伤对抗氧化应激的关键，可通过调控下游多种信号通路发挥神经保护作用^［8］。据报道，Nrf2基因敲除大鼠大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型脑损伤更大，梗死面积和神经损伤更为严重^［9］，这表明Nrf2激活在IS后氧化应激方面起着至关重要的作用。HO‑1作为Nrf2的下游靶基因，对脑缺血导致的神经损伤和自由基介导的神经元凋亡有保护作用^［10］，当HO‑1分解血红素时，产生的抗炎化合物一氧化碳（carbon monoxide，CO）可以治疗IS^［11］，Nrf2/HO‑1通路可以增强IS对氧化应激损伤的耐受性^［12］。因此，通过干预Keap1/Nrf2/HO‑1信号通路来减轻IS的氧化应激损伤，是防治IS的重要思路。

“治神调髓”针刺是刘智艳教授根据多年临床经验提出的以安神定智、调养心神、益精填髓为治疗原则的组穴针刺方案，该方案经过课题组多年研究证明对于治疗IS疗效明显，可提高脑卒中单侧空间忽略患者对单侧空间忽略的认知，改善患侧忽略程度及偏瘫肢体运动功能^［13］、生活质量^{［14，15］}；可以通过降低皮质酮（corticosterone，CORT）和促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）水平，有效改善卒中后抑郁患者神经功能^［16］。本研究在前期研究基础上，聚焦IS关键病理环节，探索“治神调髓”针刺通过Keap1/Nrf2/HO‑1信号轴改善IS大鼠氧化应激损伤的作用机制，为其临床推广提供更多理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验药品及试剂

依达拉奉右莰醇注射用浓溶液（货号：H20200007，先声药业有限公司）；苯巴比妥钠（5 g/瓶，Merck公司）；TTC染色液（2%）（货号：DK00055，北京雷根生物技术有限公司）；尼氏染色液（货号：G1436，北京索莱宝科技有限公司）；戊二醛固定液（货号：G916054，上海麦克林生化科技股份有限公司）；4% PFA固定液（货号：BL539A，白鲨生物科技有限公司）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒（货号：BC0025，北京索莱宝科技有限公司）；总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T‑SOD）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH‑PX）试剂盒（货号：A001‑1‑2、A005‑1‑2，南京建成生物）；活性氧（reactive oxygen species，ROS）试剂盒（货号：YX‑181519R，上海优选生物科技有限公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒、高效RIPA组织/细胞快速裂解液（货号：PC0020、R0010，北京索莱宝科技有限公司）；Keap1抗体（货号：TA5266F，艾比玛特）；Nrf2抗体（货号：A11159，爱博泰克）；HO‑1抗体（货号：ab189491，Abcam公司）。

1.2 实验仪器

3‑18KS型台式高速冷冻离心机（德国Sigma公司）；JXFSTPRP‑24全自动样品快速研磨仪（上海净信）；酶标仪Multiskan GO型全波长酶标仪（美国Thermo公司）；Jess全自动蛋白质表达定量分析系统（美国Protein Simple公司）；310088型高倍显微镜（日本Nikon公司）；DHP‑9162型电热恒温培养箱（上海乔欣科学仪器有限公司）。

1.3 实验动物

选取90只健康SPF级6~8周龄雄性SD大鼠，体重180~220 g，购自新疆医科大学动物验中心，动物合格证书：SCXK（新）2018‑0002，饲养温度19~25 ℃，相对湿度40%~55%，光照/黑暗周期12 h/12 h交替，经新疆医科大学动物实验中心伦理审查，伦理审批号：IACUC‑20200331‑128。

1.4 动物分组、干预及造模

1.4.1 分组及干预

大鼠适应性饲养1周后分为假手术组、模型组、普通针刺组、“治神调髓”针刺组、西药组（依达拉奉右莰醇组）。假手术组麻醉后常规备皮消毒，暴露左侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉后即可缝合；模型组、普通针刺组、“治神调髓”针刺组、西药组（依达拉奉右莰醇组）参照改良Longa线栓法制备MCAO大鼠，术后大鼠完全清醒后采用Zea‑longa神经功能评分方法对模型的神经功能缺损进行评分，以判断是否造模成功；模型组不做任何干预；普通针刺组每日针刺曲池、合谷、环跳、足三里、丰隆、太冲（取穴参照2021年中国中医药出版社出版的《实验针灸学实验指导》），每日1次，每次20 min，连续7 d；“治神调髓”针刺组每日针刺百会、肾俞、四神聪、悬钟，三阴交、内关，每日1次，每次20 min，连续7 d；西药组腹腔注射依达拉奉右莰醇注射液0.33 mL/100 g（根据说明书用于大鼠模型的等效剂量换算），每日1次，连续7 d。

1.4.2 造模方法

参照改良Longa线栓法制备MCAO大鼠^［17］，大鼠术前禁食不禁水12 h，麻醉后取仰卧位，固定四肢及头部，充分暴露颈部，备皮消毒后于颈中线作切口，充分暴露左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，然后结扎颈外动脉及颈总动脉近心端，临时用夹住颈内动脉的近端，在颈总动脉远端打一活结，于活结下方用眼科剪做一个小切口，将线栓从切口处轻轻插入颈内动脉，遇到阻力后，略拉紧活结，取下颈内动脉上的夹子，将线栓继续向内推，直到大脑中动脉的起源被阻断，线栓长度约为18~20 mm，拉紧活结，扎紧线栓，剪去线栓多余部分，然后缝合皮肤。大鼠术后完全清醒生命体征平稳后，采用Zea‑longa神经功能评分方法评估模型的神经功能缺损评分^［18］。评分范围0~4分，0分是无神经功能缺损，1分是不能完全伸展对侧前爪，2分是行走时向外侧转圈，提示中度神经功能缺损，3分是行走时向对侧倾倒，提示重度神经功能缺损，4分是不能自主行走，并且意识水平较低。分值为1~3分说明MCAO造模成功，4分为死亡。将评分在1~3分的大鼠纳入实验研究中，剔除0分和4分，得分越高，则大鼠神经功能缺损越严重。最终每组纳入12只大鼠。

1.5 实验方法

1.5.1 神经功能评分

大鼠术后完全清醒后，采用Zea‑longa神经功能评分方法评估模型的神经功能缺损评分（参照“1.4.2”项评分方法）。

1.5.2 TTC染色

将大鼠麻醉后取出完整大脑组织，置于载玻片上，放入-20 ℃冰箱20~30 min，然后将组织切成厚度约为2 mm的冠状切片，放入2% TTC溶液中，用锡纸包住避光，放入37 ℃恒温箱中30 min，注意期间不时翻动脑片，让脑片与2% TTC溶液充分接触，最后将脑片放入4%多聚甲醛溶液中放入4 ℃冰箱过夜保存固定，拍摄图像后用ImageJ软件进行图像分析，计算梗死面积百分比。

1.5.3 H&E染色

大鼠麻醉后取脑缺血区组织，用4%多聚甲醛固定，常规脱水、透明、浸蜡和石蜡包埋后切片，烤片（60 ℃左右）后二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各浸泡15min，梯度酒精100%Ⅰ、100%Ⅱ、95%、90%、85%、70%各5 min，随后，用苏木精核染，分化，伊红染液复染，再过梯度乙醇，二甲苯透明，中性树胶封片，晒干后在显微镜下观察各组大鼠病理结构。

1.5.4 尼氏染色

大鼠麻醉后取脑缺血区组织，用4%多聚甲醛固定，常规脱水、透明、浸蜡和石蜡包埋后切片，烤片（60 ℃左右）后二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各浸泡15 min，梯度酒精100%Ⅰ、100%Ⅱ、95%、90%、85%、70%各5 min，于切片上滴加2%尼氏染色液避光20 min，再过梯度乙醇，二甲苯透明，中性树胶封片，晒干，在显微镜下观察各组大鼠神经元形态。

1.5.5 透射电镜

大鼠麻醉后取脑缺血区组织，切成约1 mm³的正方体小块后放入2.5%戊二醛固定液中固定2 h以上后用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3次，每次15 min，接着使用1%锇酸固定液进行固定2~3 h后再用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗3次，每次15 min，再进行脱水、包埋、切片（70 nm），用3%醋酸铀和枸橼酸铅进行双染色，在透射电镜下观察神经元超微结构和线粒体形态，并摄片。

1.5.6 ELISA检测

大鼠麻醉后腹主动脉取血，静置30 min~2 h，离心取血清，严格按照说明书步骤，检测各组大鼠血清中MDA、T‑SOD、GSH‑PX，ROS含量。使用酶标仪测量各孔的吸光度值（OD值），并根据标准曲线计算MDA、T‑SOD、GSH‑PX，ROS的含量。

1.5.7 Western blot检测

取缺血区脑组织50 mg，加入RIPA裂解液和PMSF（每10 mg加100 μL RIPA裂解液，RIPA 裂解液∶PMSF=100∶1）充分研磨、均浆，低温离心（4 ℃、12 000 r/min）10 min，取上清液，按照BCA法测定各蛋白浓度。依据说明书，用Jess全自动蛋白质表达定量分析系统检测各组Keap1、Nrf2、HO‑1蛋白表达水平，ImageJ对条带灰度值进行分析。以目的蛋白条带灰度值与内参蛋白条带灰度值的比值为目的蛋白的相对表达量。

1.6 统计学处理

采用ImageJ及GraphPad 10.1.2统计软件对实验数据结果进行处理和分析，计量资料以\overline{x}\pm s表示，多个组间比较采用单因素进行方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能评分

大鼠MCAO模型建立完成后，治疗7 d采用Zea‑longa神经功能评分方法对大鼠的神经功能缺损进行评分。结果显示，与假手术组相比，模型组神经功能评分明显升高（P<0.01）；与模型组相比，普通针刺组神经功能评分降低（P<0.05），“治神调髓”针刺组和西药组神经功能评分明显降低（P<0.01）；与普通针刺组相比，“治神调髓”针刺组和西药组神经功能评分降低（P<0.05）；“治神调髓”针刺组和西药组之间神经功能评分差异无统计学意义（P>0.05），见图1。

2.2 TTC染色观察脑梗死面积

大鼠MCAO模型建立完成治疗7 d后，采用TTC染色法检测脑梗死面积。结果显示，与假手术组相比，模型组脑梗死面积明显增多（P<0.01）；与模型组相比，普通针刺组、“治神调髓”针刺组和西药组大鼠脑梗死面积明显减少（P<0.01）；与普通针刺组相比，“治神调髓”针刺组和西药组大鼠脑梗死面积减少（P<0.05）；“治神调髓”针刺组和西药组之间大鼠脑梗死面积差异无统计学意义（P>0.05），见图2。

2.3 H&E染色观察脑组织病理损伤

大鼠MCAO模型建立完成治疗7 d后，进行H&E染色观察各组大鼠脑缺血区病理损伤。假手术组神经元形态完整，分布均匀，边界清晰，与假手术组相比，模型组神经元受到严重损伤，大部分形态改变，核固缩深染，与模型组相比，普通针刺组神经元损伤减轻，但仍有部分细胞出现核固缩深染现象，“治神调髓”针刺组和西药组神经元损伤大幅减轻，细胞数量明显增加，细胞核固缩深染少，且明显优于普通针刺组，见图3。

2.4 尼氏染色观察神经元

大鼠MCAO模型建立完成治疗7 d后，进行尼氏染色观察各组大鼠神经元形态。假手术组神经元形态完整，可见细胞内尼氏小体，模型组则神经元受到严重损伤，细胞固缩，核碎裂溶解，尼氏小体消失，与模型组相比，普通针刺组神经元损伤减轻，部分细胞形态恢复，“治神调髓”针刺组和西药组神经元损伤大幅减轻，细胞数量明显增加，尼氏小体也大幅增多，见图4。

2.5 透射电镜

大鼠MCAO模型建立完成治疗7 d后，在透射电镜下对各组观察。与模型组相比，假手术组细胞和细胞核形态规则，双核膜结构清晰，核周隙未见明显增宽，染色质分布均匀；普通针刺组和西药组细胞和细胞核形态不规则，胞质电子密度增高，细胞核凹凸不平，核周隙增宽，大量线粒体肿胀，嵴结构模糊或减少，基质电子密度降低，内质网扩张；“治神调髓”针刺组细胞核形态较规则，双核膜结构清晰，核周隙未见明显增宽，染色质分布均匀，少量线粒体肿胀，嵴结构模糊或减少，基质电子密度降低，内质网结构清晰，未见明显异常，见图5。

2.6 ELISA检测各组血清T‑SOD、MDA、GSH‑PX、ROS含量

大鼠MCAO模型建立完成治疗7 d后，对各组大鼠血清中T‑SOD、MDA、GSH‑PX、ROS含量进行检测。结果显示，与假手术组相比，模型组血清中T‑SOD、GSH‑PX含量明显降低（P<0.01），MDA、ROS含量明显升高（P<0.01）；与模型组相比，普通针刺组、“治神调髓”针刺组和西药组血清中T‑SOD、GSH‑PX含量明显升高（P<0.01），MDA、ROS含量明显降低（P<0.01）；与普通针刺组相比，“治神调髓”针刺组和西药组血清中T‑SOD、GSH‑PX含量升高（P<0.05），MDA、ROS含量明显降低（P<0.05）；“治神调髓”针刺组和西药组血清中T‑SOD、GSH‑PX、MDA、ROS含量差异无统计学意义（P>0.05），见图6。

2.7 Western blot检测各组Keap1、Nrf2、HO‑1蛋白表达水平

大鼠MCAO模型建立完成治疗7 d后，用Western blot检测Keap1、Nrf2、HO‑1蛋白表达水平。结果显示，与假手术组相比，模型组Keap1蛋白表达水平明显升高（P<0.01），Nrf2和HO‑1蛋白表达水平明显降低（P<0.01）；与模型组相比，普通针刺组Keap1蛋白表达水平降低（P<0.05），Nrf2和HO‑1蛋白表达水平升高（P<0.05），“治神调髓”针刺组和西药组Keap1蛋白表达水平明显降低（P<0.01），Nrf2和HO‑1蛋白表达水平明显升高（P<0.01）；与普通针刺组相比，“治神调髓”针刺组和西药组Keap1蛋白表达水平降低（P<0.05），Nrf2和HO‑1蛋白表达水平升高（P<0.05）；“治神调髓”针刺组与西药组之间Keap1、Nrf2、HO‑1蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05），见图7。

3 讨论

IS的发病机制是多方面的，氧化应激与IS许多生理和病理过程密切相关，是IS损伤的关键原因^［19］。在脑缺血发生时，缺血诱导的功能障碍的线粒体导致ROS的大量产生^［20］，ROS的过度产生会导致抗氧化防御系统失衡，从而诱导氧化应激损伤^{［21，22］}。Keap1与细胞质中的Nrf2结合可抑制ROS的过量产生^［23］。在氧化应激条件下中，细胞受到过载的ROS攻击，Keap1与Nrf2结构域改变，转移到细胞核的Nrf2磷酸化并形成形成异二聚体，与抗氧化反应元件结合，激活调控下游的HO‑1等抗氧化基因的表达^［24］，因此，Keap1/Nrf2/HO‑1是降低氧化应激的重要信号轴^［25］。研究表明，Nrf2可以通过清除细胞ROS和恢复氧化还原平衡减轻氧化应激损伤^［26］，增强HO‑1、GSH‑PX、T‑SOD等抗氧化剂的抗氧化性能^［27］。本研究首先构建了MCAO大鼠模型，发现与假手术组相比，模型组神经功能学评分明显下降，神经元损伤严重，脑梗死面积大，血清中T‑SOD、GSH‑PX明显降低（P<0.01），MDA、ROS含量明显升高（P<0.01），脑组织Keap1蛋白表达水平升高（P<0.01），Nrf2、HO‑1蛋白表达水平降低（P<0.01），上述结果表明，IS能激活Keap1/Nrf2/HO‑1信号轴，通过调控氧化应激反应影响脑内神经组织的缺血性氧化损伤程度。

IS在中医学属于“中风”范畴，其病因病机通常被认为是正气不足、饮食情志、劳倦内伤，引起气血逆，风、火、痰、瘀扰上窍，损伤脑络^［28］，基本治法是化痰通络、益气活血化瘀、开窍醒脑^［29］。“治神调髓”针刺以百会、肾俞、四神聪、悬钟，三阴交、内关作为针刺点组穴。百会是头部穴位，督脉之会，有开窍醒脑，双向调节气血经络之效^［30］，电针百会可以抑制ROS的产生，使MDA水平下降，改善神经功能，发挥神经保护作用^［31］；肾俞是足太阳膀胱经的常用腧穴之一，具有补益肾脏、益精生髓的作用，电针肾俞可以清除ROS，减少MCAO大鼠脑组织氧化应激反应^［32］，与百会上下配穴，可达到温通经络，调整阴阳的目的；四神聪位于头部，能安神定志，改善脑部血液循环，与百会配穴，可以通过减少MDA，增加SOD、GSH水平，提高MCAO大鼠抗氧化能力，减轻氧化应激损伤^［33］；悬钟则能通经活络，调和气血，与百会配穴，可达到濡养脑络，益髓充脑的目的^［34］；三阴交为足三阴交会之穴，有研究证明针刺三阴交可以激活并改善脑区功能，能达到醒脑开窍的目的^［35］；内关为八脉交会之穴，研究发现针刺内关可以明显改善MCAO大鼠脑梗死面积，恢复神经功缺失症状^［36］。这些穴位相互配合，可能通过调节氧化应激通路，抑制ROS的产生，减少MDA等氧化物水平，增加SOD、GSH等抗氧化物水平，减轻氧化应激损伤，发挥填精益髓，调神醒脑之功，达到治神调髓，显肾脑相济的目的。本研究表明，与模型组对比，“治神调髓”针刺组大鼠脑组织脑梗死面积明显减少（P<0.01），脑细胞和神经元数量增多，缺血脑组织Keap1蛋白表达量减低，Nrf2及HO‑1蛋白表达量升高（P<0.01），同时，血清中T‑SOD、GSH‑PX等抗氧化物水平升高，氧化应激损伤标记物MDA、ROS水平降低（P<0.01），由此可以推测“治神调髓”针刺可以通过激活Keap1/Nrf2/HO‑1信号轴平衡氧化还原稳态，从而达到减轻氧化应激损伤，治疗IS的目的。本研究还进一步发现，在下调血清中MDA、ROS含量与缺血脑组织中Keap1蛋白表达水平，上调血清中T‑SOD、GSH‑PX含量与缺血脑组织Nrf2和HO‑1蛋白表达水平“治神调髓”针刺组明显优于普通针刺组（P<0.05），原因可能是针刺百会、肾俞、四神聪等穴位对氧化与抗氧化的核心机制有调节作用^［37］；此外在降低血清中MDA、ROS含量及缺血脑组织中Keap1蛋白表达水平，同时提升血清中T‑SOD、GSH‑PX含量，缺血脑组织Nrf2和HO‑1蛋白表达水平方面“治神调髓”针刺组与西药组差异无统计学意义（P>0.05）。西药依达拉奉右莰醇治疗IS的机制是清除氧自由基，抑制过氧化物反应及减少炎症因子的释放，调控氧化应激—炎症联级反应，从而达到保护脑细胞，修复神经元，改善神经功能的作用^［38］，该药物在临床上治疗优势明显，应用前景广泛，但缺乏足够的临床试验数据，价格较为昂贵，在此背景下，“治神调髓”针刺提供了一种有效的补充选择，其疗效不逊于依达拉奉右莰醇，较之于普通针刺提升明显，而且针刺治疗IS历史悠久，已有大量研究支持，副作用小，其价格相比于依达拉奉右莰醇更为经济，作为一种兼具效益与安全性的非药物替代方案，对临床选择具有指导价值。

本次实验有几个局限性：此次只简单验证了Keap1/Nrf2/HO‑1信号轴上的几个标志物的变化，确定了“治神调髓”针刺的抗氧化作用，未深入探究其具体机制，虽然设立了依达拉奉右莰醇对照组，也通过尼氏染色及透射电镜等方法比较，发现“治神调髓”针刺可以使神经元损伤得到大幅改善，改善神经炎症，但未明确具体靶点，因此，未来可以检测Nrf2的核转位、DNA结合活性；检测下游更多抗氧化酶（如NQO1）的表达；使用通路抑制剂或激动剂进行反向验证；探讨针刺信号如何从穴位传入并最终影响中枢该通路等方式，进一步深入探索“治神调髓”针刺治疗IS如何在此通路上发挥作用。

作者贡献度说明：

李玲玲：实验实施、数据整理、论文撰写；徐银凤：数据整理、结果分析；谢姗珊、智勇：实验设计、论文审校。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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基金资助

国家自然科学基金(82560970)

国家自然科学基金(82060894)

新疆维吾尔自治区区域协同创新专项(2022E01043)