Pfu-sso7d DNA聚合酶的制备及反应缓冲液的研究

摘要

目的：制备有高效扩增长片段以及复杂片段能力的Pfu DNA聚合酶。方法：运用基因工程学方法构建重组质粒pET-28a-Pfu-sso7d，采用优化后的诱导条件对pET-28a-Pfu-sso7d实行诱导表达，将菌液超声破碎并提取上清液，应用镍亲和层析洗脱纯化取得较纯Pfu-sso7d DNA聚合酶。采用qPCR方法对酶进行酶活力单位定量、确定反应缓冲液组分最佳浓度及检测自制Pfu-sso7d DNA聚合酶酶活性。结果：在1 mmol·L^-1 IPTG、16℃条件下诱导Pfu-sso7d DNA聚合酶菌液16 h,Pfu-sso7d DNA聚合酶高效表达；用20～100 mmol·L^-1咪唑可将蛋白洗脱。Pfu-sso7d DNA聚合酶最终活力单位定量为1 U·μL^-1。PCR最佳反应缓冲液为pH9.0、20 mmol·L^-1 Tris-HCl、0.6 mmol·L^-1 MgSO₄、50 mmol·L^-1 KCl、5 mmol·L^-1 （NH₄）₂SO₄、0.1%Triton X-100，添加剂组分为3%DMSO、1 mol·L^-1甜菜碱。Pfu-sso7d DNA聚合酶能高效扩增3 000 bp的目的条带，活性达到商用高保真DNA聚合酶水平。结论：基于基因重组制备的Pfu-sso7d DNA聚合酶可进行高效的PCR反应，节省了实验室PCR成本，为进一步提高Pfu DNA聚合酶活性提供一定技术参考。

关键词

聚合酶链式反应 / Pfu DNA聚合酶 / Sso7d / 反应缓冲液