RNA-蛋白质复合物规模化富集与鉴定新方法

摘要

RNA-蛋白质复合物调控着生物体内各种生理过程,在RNA从合成到降解的生理活动历程中发挥关键作用.为了更全面解析RNA-蛋白复合物(RNA-protein complexes, RPC)相互作用网络,近年来研究者除了开发RNA直接结合蛋白(RNA-binding proteins, RBP)规模化富集方法,也将目光转向了与RBP存在相互作用的RNA间接结合蛋白(RNA-associated proteins, RAP),二者与RNA共同组成了结构复杂、功能各异的RPC.但以往方法均将RPC中包含的所有蛋白视为整体,统一鉴定,缺乏能够规模化区分RBP和RAP的有效途径.基于此,本文联合使用254 nm紫外交联法和二硫双琥珀酰亚胺丙酸酯(DSP)蛋白交联剂,通过不同反应原理将RBP与RAP分别富集于链霉素磁珠,进而通过分步洗脱方法分别获取纯化的RBP和RAP,并结合质谱分析实现二者的各自独立鉴定.采用该方法在HeLa细胞中共鉴定到2007个高置信RBP, 927个高置信RAP,其中有243个RAP为首次鉴定.此方法的建立有助于细化RPC中各组分间的相互作用网络,为后续的生物应用提供方法和数据基础.

关键词

RNA结合蛋白 / 蛋白质组学 / 富集 / 分离 / 质谱