肺癌发病率和死亡率排世界首位,其中约三分之一的新发病例和死亡病例来自中国
[1]。目前,以顺铂为基础的联合化疗是晚期肺癌患者的最佳治疗方案,而化疗耐药极大地降低治疗的成功率,因此全面了解肺癌化疗耐药是亟待解决的问题
[2]。
前期研究发现,干扰糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK3β)可以活化Wnt/β-catenin信号通路,在Wnt/β-catenin信号通路被激活的情况下,使用补中益气汤干预A549/DDP细胞仍可以改善A549/DDP细胞顺铂耐药
[3]。因此,推测补中益气汤可以抑制Wnt/β-catenin信号通路改善A549/DDP细胞顺铂耐药,即补中益气汤具有沉默连环蛋白β1(β-catenin)的同等效应。本研究利用siRNA技术干扰β-catenin,抑制Wnt/β-catenin信号通路,检测A549/DDP细胞的Survivin表达、顺铂IC
50及顺铂诱导的总凋亡率,探讨补中益气汤含药血清和瞬时转染Siβ-catenin在抑制Wnt/β-catenin信号通路改善肺腺癌顺铂耐药性方面是否具有协同效应,证实补中益气汤具有siβ-catenin瞬时转染样效应。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物及细胞株
SPF级SD大鼠,供自辽宁中医药大学动物实验中心(合格证号SCXK(辽)2020-0001),已获得辽宁中医药大学医学与动物伦理审查委员会审查批准(批准号:210726221100791635),体质量170~210 g。A549/DDP细胞株购自中国医科院肿瘤研究中心细胞库。
1.1.2 主要试剂
本实验中所用siRNA采购于吉玛基因公司;LipofectamineTM2000转染试剂(产品批号:11668)供自invitrogen公司(美国);β-catenin一抗、全蛋白提取试剂盒、Survivin一抗、BCA蛋白浓度测定试剂盒以及ECL发光液、β-actin一抗、AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒(产品批号:WL01456、WLA001c、WLA003、WL01684、WL0961a、WLA019、WL0002、WLA020)均供自沈阳万类生物科技有限公司;RIPA裂解液、羊抗兔IgG-HRP以及胰酶(产品批号:P0013B、A0208、C0203)、均供于碧云天生物科技有限公司;顺铂(产品批号:MB1055)购于大连美仑生物技术有限公司;DMSO以及MTT检测试剂盒(产品批号:M-2128、D-5879)均购于Sigma公司(美国);胎牛血清(产品批号:SH30084.03)Hyclone公司(美国)产品;PBS(产品批号:P10033)由双螺旋公司生产。
1.1.3 含药血清的制备
根据最新全国高等中医药院校规划教材《方剂学》(第十版),补中益气汤配方及用量为:黄芪18 g(根部,货号2111251,产地甘肃),甘草片9 g(根茎,货号2102261,产地内蒙古),人参片6 g(根部,货号2111091,产地吉林),当归3 g(根部,货号2201072,产地甘肃),橘皮6 g(干燥成熟果皮,货号2111203,产地浙江),升麻6 g(根茎,货号 2011091,产地黑龙江),北柴胡6 g(根部,货号2110093,产地陕西),白术9 g(根茎,货号2110122,产地安徽),药材购自辽宁中医药大学附属医院药房,产自安徽普仁中药饮片公司,并由辽宁中医药大学药理实验室鉴定均为正品,本次实验沿用课题组前期实验补中益气汤的处方剂量
[3-5],计算出大鼠的等效剂量,实验大鼠给予灌胃处理,每日1次(1.314 g/mL,2 mL),持续7 d,末次灌胃处理1 h后腹主动脉取血,制备补中益气汤含药血清备用,放置在无菌管中,随后在37 ℃水浴环境下静置时长30 min,低速离心10 min后取上清液,再重复离心2次,56 ℃水浴灭活30 min,0.22 μm滤器滤过除菌,-20 ℃冻存备用。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
镜下观察A549/DDP细胞,当细胞长到80%,将培养液弃用,使用0.25%浓度胰酶1 mL,将细胞消化2 min左右,显微镜下观察到细胞形态卷缩变圆后,加入2 mL培养基终止消化。在培养瓶中加入5 mL 10%浓度的含有胎牛血清的RPMI-1640培养液将细胞吹打均匀。随机分装入新的培养瓶中,继续传代培养。将所需的A549/DDP细胞随机分组,用于后续实验。
1.2.2 siRNA干扰
按常规方法在6孔板之中(3×105个/孔)接种细胞,过24 h进行转染,保证细胞密度在转染时占50%~80%,转染后DDP(20 μmol/L)处理48 h。将β-catenin siRNA和阴性对照siRNA经LipofectamineTM2000转染试剂分别转入A549/DDP细胞中。随机分5组:正常血清组、顺铂组、siCTNNB1-235组、siCTNNB1-510组、siCTNNB1-547组。参照siRNA的设计原则,CTNNB1-235的干扰序列正义链为5’-GUAGCUGAUAUUGAUGGACTT-3’,反义链为5’-GUCCAUCAAUAUCAGCUACTT-3’;CTNNB1-510的干扰序列正义链为5’-GGCUGCAGUUAUGGUCCAUTT-3’,反义链为5’-CUUAGAUGGACCAUAACUGCAGCCTT-3’;CTNNB1-547的干扰序列正义链为5’-GCUUCCAGACACGCUAUCATT-3’,反义链为5’-UGAUAGCGUGUCUGGAAGCTT-3’。
1.2.3 实验分组及给药方法
将β-catenin表达受抑后的A549/DDP细胞进行随机分组,实验所需的补中益气汤含药血清按上述操作制备,实验中所需顺铂的药物浓度为20 μmol/L,随机分6组:A549/DDP+正常SD大鼠血清组(10%正常血清处理)、A549/DDP细胞+siCTNNB1+正常SD大鼠血清组、A549/DDP细胞+含药血清组、A549/DDP细胞+siCTNNB1+顺铂+正常SD大鼠血清组(20 μmol/L顺铂与10%正常血清共同处理)、A549/DDP细胞+顺铂+siCTNNB1+含药血清组(20 μmol/L顺铂与10%补中益气汤含药血清共同处理)、A549/DDP细胞+siCTNNB1+含药血清组。
1.2.4 蛋白质印迹检测β-catenin干扰后蛋白表达量
将A549/DDP细胞收集至洁净EP管中,用RIPA裂解液(0.1% SDS;1% NP40;0.1 mmol/L PMSF;1×PBS)于冰上裂解30 min,BCA法测定蛋白浓度,配置分离胶并将其灌入玻璃板下2/3的位置,再将浓缩胶灌入玻璃板上1/3的位置,待浓缩胶凝固后将梳子拔掉,并加样,电泳后,转膜至PVDF膜,配置5%的脱脂奶粉,将膜封闭处理,并放在脱色摇床上摇动2 h,TBST洗膜3次,每次5 min,一抗(将Survivin、β-catenin稀释至1∶500浓度),4 ℃冰箱冷藏下孵育过夜,用TBST洗膜5 min,洗3次,二抗(羊抗兔IgG-HRP按照1∶5 000浓度比例稀释)室温状态下温浴2 h,在暗室用DAB试剂盒显色试剂发光,将胶片扫描或拍照,得到目标图像。得到目的蛋白条带和内参条带图像,从而测得蛋白质表达水平。
1.2.5 MTT法检测顺铂的IC50
贴壁生长的细胞用0.25%胰蛋白酶消化,吹打制成细胞悬液,用含10%胎牛血清的培养液调整细胞浓度为105/mL,于96孔板中每孔加入100 μL,培养24 h不同浓度顺铂进行处理。一般培养条件下培养细胞48 h,在每孔中加入20 μL、5 mg/mL的MTT溶液,孵育4 h后,弃去液体培养基,加入150 μL DMSO,在摇床上通过10 min的振荡,使结晶物溶解充分,将酶标仪置于570 nm波长下测得光吸收值(A值)。
1.2.6 Annexin V/PI染色法检测凋亡率
贴壁生长的细胞用0.25%胰蛋白酶消化1 min左右,低速离心后弃上清,PBS洗涤细胞2次,取1×106/mL的细胞待检测,加入250 μL结合缓冲液,使其成为浓度(2~5)×105/mL的细胞悬液。取195 μL细胞悬液加入Binding Buffer和FITC标记的Annexin V-FITC 5 μL以及浓度为20 μg/mL碘化丙锭(PI)溶液10 μL,室温避光处理30 min,再加入300 μL的结合缓冲液,轻轻混匀,2 min后于流式细胞仪上(激发光波长488 nm)进行结果检测分析。
1.3 统计学方法
使用SPSS 17. 0软件对数据进行分析统计,计量资料以均数±标准差( ±s)表示。组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t法,检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 沉默β-catenin对各组β-catenin蛋白表达量影响
Western blot结果:由蛋白marker显示,各组均在92 kD处显示条带,则各组β-catenin均有表达。以相对分子质量为43 kD的β-actin作为内参,应用Image J软件定量分析β-catenin蛋白表达水平。正常血清组、顺铂组、siCTNNB1-235组、siCTNNB1-510组、siCTNNB1-547组分别为:1.00、0.977±0.015、0.323±0.021、0.570±0.020、0.723±0.025。方差分析5组β-catenin蛋白表达的差异,差异有统计学意义(
F=714.980,
P=0.000)。如
图1、
图2结果显示,与顺铂组比较,瞬时转染CTNNB1-235特异性siRNA组总β-catenin表达强度明显降低(
t=43.830,
P=0.000)。以正常血清A549/DDP组蛋白表达量为基准,特异性β-catenin siRNA对β-catenin表达抑制率达67%。而瞬时转染阴性对照siRNA(顺铂)组细胞β-catenin蛋白表达量变化不明显(
t=2.646,
P=0.152)。此结果进一步说明本实验设置的对于β-catenin siRNA有较强特异性,且阻抑效果显著。
2.2 β-catenin表达受抑对各组A549/DDP细胞β-catenin、Survivin蛋白表达的影响
图3、
5结果显示,正常血清组、siCTNNB1+正常血清组、含药血清组、siCTNNB1+顺铂+正常血清组、siCTNNB1+顺铂+含药血清组和siCTNNB1+含药血清组β-catenin蛋白表达水平分别为:1.00、0.453±0.021、0.458±0.020、0.387±0.015、0.247±0.015、0.323±0.252。方差分析6组β-catenin蛋白表达的差异,差异有统计学意义(
F=838.916,
P=0.000)。与正常血清组比较,siCTNNB1+正常血清组和含药血清组均能降低β-catenin蛋白表达量(
t=45.490,
P=0.000;
t=46.430,
P=0.000),而siCTNNB1+正常血清组和含药血清组两组间无明显差异(
t=0.299,
P=0.709)。与siCTNNB1+正常血清组比较,siCTNNB1+顺铂+正常血清组和siCTNNB1+含药血清组β-catenin蛋白表达水平降低(
t=4.472,
P=0.000;
t=13.860,
P=0.000)。与siCTNNB1+顺铂+正常血清组相比,siCTNNB1+顺铂+含药血清组β-catenin蛋白表达量也降低(
t=11.220,
P=0.000)。
图4、
5结果显示,正常血清组、siCTNNB1+正常血清组、含药血清组、siCTNNB1+顺铂+正常血清组、siCTNNB1+顺铂+含药血清组和siCTNNB1+含药血清组Survivin蛋白表达水平分别为:1.00、0.523±0.015、0.503±0.015、0.356±0.005、0.257±0.015、0.313±0.015。方差分析6组Survivin蛋白表达的差异,差异有统计学意义(
F=1 369.468,
P=0.000)。与正常血清组比较,siCTNNB1+正常血清组和含药血清组均能降低Survivin蛋白表达量(
t=54.050,
P=0.000;
t=56.320,
P=0.000),而siCTNNB1+正常血清组和含药血清组两组间无明显差异(
t=0.184,
P=0.077)。与siCTNNB1+正常血清组比较,siCTNNB1+顺铂+正常血清组和siCTNNB1+含药血清组Survivin蛋白表达水平降低(
t=18.020,
P=0.000;
t=21.380,
P=0.000)。与siCTNNB1+顺铂+正常血清组相比,siCTNNB1+顺铂+含药血清组Survivin蛋白表达量也降低(
t=10.640,
P=0.000)。
2.3 β-catenin表达受抑对各组A549/DDP细胞IC50的影响
图6中MTT结果显示,正常血清组、含药血清组、siCTNNB1+正常血清组、siCTNNB1+含药血清组的IC
50分别为:(28.330±1.029) μmol/L、(20.350±1.155) μmol/L、(15.577±1.535) μmol/L、(10.453±0.999) μmol/L,4组比较差异有统计学意义(
F=120.493,
P=0.000)。与正常血清组比较,补中益气汤含药血清可降低A549/DDP细胞顺铂的IC
50(
t=8.932,
P=0.000)。与含药血清组或siCTNNB1+正常血清组比较,siCTNNB1+含药血清组A549/DDP细胞顺铂的IC
50显著降低(
t=11.220,
P=0.001;
t=4.844,
P=0.000)。
2.4 β-catenin表达受抑对各组A549/DDP细胞凋亡的影响
由
图7、
8的Annexin V/PI染色法的流式细胞术结果显示,正常血清组、顺铂组、siCTNNB1+顺铂组、顺铂+含药血清组的总凋亡率分别为:(9.130±0.384)%、(34.367±0.631)%、(64.393±0.244)%、(70.120±0.400)%,差异具有统计学意义(
F=12 563.734,
P=0.000)。单独使用顺铂时,A549/DDP细胞的顺铂诱导总凋亡率明显增加(
t=59.140,
P=0.000);瞬时转染CTNNB1-235联合顺铂,A549/DDP细胞的顺铂诱导总凋亡率进一步增加(
t=210.200,
P=0.000);补中益气汤联合顺铂后A549/DDP细胞顺铂诱导总凋亡率增加最明显(
t=190.400,
P=0.000)。
3 讨论
中医认为,肿瘤长居体内,会不断吸收五脏精微,则亏损五脏之精,导致精不足以化气而气虚
[6]。因此治则需益气健脾,扶助正气
[7]。根据中医五行相生理论“培土生金”法,选择代表方剂补中益气汤治疗肺癌耐药得到良好的疗效
[3-5]。前期研究也显示,补中益气汤可以明显改善肿瘤对顺铂的耐药性,提高肿瘤细胞对顺铂的药物敏感性
[8],有利于化疗的继续治疗,延长肺癌患者寿命、提高生存质量,为中医药治疗或缓解癌症症状提供新的思路。
Wnt/β-catenin信号通路与肿瘤发生、发展、转移及耐药关系十分密切
[9]。β-catenin是一种多功能蛋白质,在内环境稳定中起着核心作用。β-catenin过高表达会导致各种疾病,包括癌症
[10]。当Wnt/β-catenin信号通路被激活,β-catenin从细胞质向细胞核转移,使得细胞增殖加快、产生凋亡抵抗,也提高A549/DDP细胞对顺铂的耐药性
[11]。Survivin是Wnt/β-catenin信号通路下游的靶基因,是最强的凋亡抑制蛋白之一,只在肿瘤细胞和胚胎组织中表达,并与肿瘤治疗抵抗相关
[12]。当Wnt/β-catenin信号通路被抑制,能显著降低A549/DDP对顺铂的耐药性,同时也能下调Survivin蛋白表达
[3]。这些研究不仅支持本研究的结果,而且可能解释Survivin诱导途径的中断导致细胞凋亡增加和肿瘤生长抑制的分子机制
[13]。本研究发现补中益气汤干预或干扰β-catenin均能下调β-catenin、Survivin蛋白表达,降低顺铂的IC
50,并提高顺铂诱导的总凋亡率,且补中益气汤干预和干扰β-catenin 2组之间无明显差异。以上结果证明,补中益气汤干预与干扰β-catenin具有类似的作用,均可通过抑制抗凋亡蛋白Survivin的表达而促进细胞凋亡的发生,进而降低顺铂的半数抑制浓度,增加耐药细胞对顺铂的敏感性,改善顺铂耐药的发生。而当补中益气汤联合干扰β-catenin时,β-catenin、Survivin蛋白的表达下调、顺铂的IC
50降低及顺铂诱导总凋亡率的提高均比补中益气汤联合顺铂干预或干扰β-catenin时更加明显,证明补中益气汤干预和干扰β-catenin在改善顺铂耐药方面具有协同效应。本研究进一步证实补中益气汤可以通过调控Wnt/β-catenin信号通路而干预肺癌的顺铂耐药性。β-catenin作为Wnt/β-catenin通路的核心信号分子,是肿瘤耐药的重要干预靶点之一,本研究证实补中益气汤具有β-catenin干扰作用,并与其存在协同效应,为临床寻求中医药改善肺癌顺铂耐药的有效靶点提供可参考的实验依据。综上所述,补中益气汤通过抑制A549/DDP细胞β-catenin及下游靶基因Survivin的表达、降低顺铂的IC
50数值、增加顺铂诱导的总凋亡率,从而发挥改善肺腺癌顺铂耐药的作用。补中益气汤含药血清联合顺铂和干扰β-catenin在抑制Wnt/β-catenin信号通路改善肺腺癌顺铂耐药性方面具有协同效应,且补中益气汤具有干扰β-catenin样效应。本研究为将来拓展肺癌顺铂耐药提供新的思路与方法。