PSME1/2通过抑制CDK15的表达促进子宫内膜癌细胞的增殖和侵袭

Proteasome activator subunit 1/2 promotes the proliferation and invasion of endometrial carcinoma cells by inhibiting the expression of cyclin-dependent kinase 15

摘要

目的 探索人类蛋白酶体激活剂（proteasome activator subunit，PSME）1/2在子宫内膜癌（endometrial carcinoma，EC）中的表达水平及其对EC细胞增殖和侵袭的影响。 方法 检测子宫内膜细胞系和原代细胞中PSME1/2和细胞周期蛋白依赖性激酶15（cyclin-dependentkinase 15，CDK15）的表达，以敲低株分析PSME1/2与CDK15的表达相关性及其对肿瘤增殖和侵袭影响。比较PSME1/2和CDK15在EC组织和癌旁组织中的表达水平差异，并分析其对EC患者预后的影响。 结果 与人正常子宫内膜细胞系相比，PMSE1/2在HEC1B（human endometrial adenocarcinoma cells，HEC1B）及原代细胞中mRNA（messenger RNA，mRNA）高表达和蛋白高表达，CDK15蛋白表达量下降。与对照组和双敲组比，CDK15在HEC1B系PSME1/2敲低株的蛋白表达升高，提示CDK15可能受PSME1/2抑制。在EC组织PMSE1/2高表达，CDK15低表达。PSME1/2表达与患者临床资料如年龄、术后诊断分型、分化程度、术后分期等差异无统计学意义（P>0.05）。PSME1/2、CDK15的表达与EC患者的不良预后无明显相关性（P>0.05）。 结论 PSME1/2抑制CDK15的表达而促进EC细胞的增殖和侵袭，PSME1/2具有促EC作用。

Abstract

Objective To investigate the expression level of proteasome activator subunit 1/2（PSME1/2） in endometrial carcinoma and its effect on the proliferation and invasion of endometrial carcinoma cells. Methods The expression levels of PSME1/2 and cyclin-dependent kinase 15（CDK15） were measured in endometrial cell lines and primary cultured cells，and knock-down strains were used to analyze the correlation between PSME1/2 and CDK15 and the effect of PSME1/2 on tumor proliferation and invasion. The expression levels of PSME1/2 and CDK15 were compared between endometrial carcinoma tissue and paracancerous tissue，and the influence of PSME1/2 and CDK15 on the prognosis of patients with endometrial carcinoma was analyzed. Results Compared with normal human endometrial cell lines，human endometrial adenocarcinoma HEC1B cells and primary cultured cells had high mRNA and protein expression levels of PMSE1/2 and a reduction in the protein expression of CDK15. Compared with the control group and the double knock-down group，there was an increase in the protein expression level of CDK15 in the HEC1B line with PSME1/2 knock-down，suggesting that CDK15 might be inhibited by PSME1/2. There was a high expression level of PMSE1/2 and a low expression level of CDK15 in endometrial carcinoma. There were no significant differences in age，postoperative diagnosis and typing，degree of tumor differentiation，and postoperative stage between the high PSME1/2 expression group and the low PSME1/2 expression group（P>0.05）. There was no significant correlation between the expression of PSME1/2 and CDK15 and the poor prognosis of patients with endometrial carcinoma（P>0.05）. Conclusion PSME1/2 can inhibit the expression of CDK15 and promote the proliferation and invasion of endometrial carcinoma cells，and PSME1/2 can also promote endometrial carcinoma.

关键词

人类蛋白酶体激活剂1/2 / 细胞周期蛋白依赖性激酶15 / 子宫内膜癌 / 增殖 / 侵袭

Key words

proteasome activator subunit 1/2 / cyclin-dependent kinase 15 / endometrial carcinoma / proliferation / invasion

子宫内膜癌（endometrial carcinoma，EC）是最常见的妇科癌症，近几年来新发病例逐年增长，严重影响着广大女性朋友的生命健康。在世界范围内，EC占所有新发癌症病例总数的3.5%^[1-2]。我国每年大约有5万新发EC患者，死亡率36%^[3]。高危患者中EC的复发率约为13%^[4]。因此，发现新的标志物筛查手段、延缓或控制肿瘤的进展及开发新的治疗方案对改善患者的预后有非常重大的意义。

人类蛋白酶体激活剂（proteasome activator subunit，PSME）为蛋白酶多肽酶活性的激活因子，调节蛋白酶体的功能，是普遍存在于真核细胞胞浆和胞核中具有降解细胞内蛋白质作用的蛋白酶体的激活剂之一，其家族成员共有4个，分别是PSME1（PA28α）、PSME2（PA28β）、PSME3（PA28γ）和PSME4（PA200）^[5]。PSME1和PSME2常优先形成异二聚体，结合于蛋白酶体的开放点，激活酶体，通过促进外来抗原降解产生抗原肽，参与主要组织相容性复合体Ⅰ类抗原（mhci antigen integrity Ⅰ，MHCⅠ）的提呈 ^[6]。而多项研究表明，PSME1和PSME2在多种癌症中表达失调，提示其可能作为疾病治疗的潜在靶点及预后指标^[7]。细胞周期蛋白依赖性激酶15（cyclin-dependentkinase 15，CDK15）是细胞周期依赖性激酶（cyclin dependent kinase，CDKs）家族成员之一，CDK家族的一些家族成员参与细胞转录调节，而CDK15的具体作用还尚未明确，既往研究发现其与CDK14具有同源性，存在于PFTAIRE和PCTAIRE家族中^[8]，并且可能与抑制癌症的侵袭、迁移和转移相关^[9]。

PSME1/2在乳腺癌中表达增高，PSME2在子宫内膜癌中的也呈现高表达^[10-11]。有研究发现PSME1/2的上调抑制了CDK15的表达，促进了乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移^[12]。而在EC中，少见相关研究报道。因此，本研究检测了PSME1/2、CDK15在hEEC人正常子宫内膜细胞系、人子宫内膜腺癌细胞（human endometrial adenocarcinoma cells，HEC1B）和HEC-251 EC细胞系、原代细胞中表达情况，分析了二者之间的相关性，以及其对EC细胞系恶性生物学行为的影响；并且通过对本中心98例EC患者标本检测及随访数据的分析，探究了二者表达水平与临床病理因素和患者预后的相关性，为EC治疗提供新的靶点和思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2016年至2020年重庆医科大学附属永川医院妇产科EC患者的手术标本（分别取EC组织和癌旁正常组织），共98例，记录好患者的基本信息（包括性别、年龄、住院号、联系方式）、术中浸润深度、病理编号、术后治疗方案等。标本采集征得患者及家属同意，本研究获重庆医科大学附属永川医院伦理委员会批准（批准号：2020年科伦审145号）。所有的子宫内膜癌患者术前未接受新辅助治疗，依据FIGO指南行手术治疗，其中腺癌95例，浆液性癌3例；高分化32例，中分化49例，低分化17例；I期72例，Ⅱ期7例，Ⅲ期17例，Ⅳ期2例；这些组织的病理结果经本院病理科医师诊断证实。收集的组织一部分用福尔马林固定石蜡包埋用于免疫组织化学染色技术（immunohistochemical staining technique，IHC），其余另一部分存储于-80℃冰箱中用于信使RNA（messenger RNA，mRNA）和蛋白质提取。

1.2 试剂与抗体

人永生化正常子宫内膜细胞hEEC、子宫内膜腺癌细胞株HEC1B、HEC-251购自上海雅吉生物科技，原代细胞为由高表达PSME1/2的低分化腺癌患者标本培养的原代细胞系；siRNA干粉购自北京擎科生物科技有限公司；细胞培养基购自武汉普诺赛公司；新生胎牛血清购自美国Scitecher公司；转染试剂购自美国Thermo Fisher公司；用于免疫组化的兔抗人PSME1、PSME2、CDK15抗体及DAB试剂盒购自北京ZSGB-BIO公司；RNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司；逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒、蛋白免疫印迹试剂盒购自美国Gibco公司；蛋白提取试剂盒购自北京诺博莱德公司；GAPDH引物购自美国CST公司；CCK-8试剂盒购自上海语纯生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学染色

新鲜组织标本离体后，用中性福尔马林浸泡，石蜡包埋后切成薄片。组织切片于60 ℃下烘烤1 h，用二甲苯进行脱蜡、梯度酒精水化处理，用柠檬酸盐浸泡置于微波炉中加热进行抗原修复。3％过氧化氢去离子水孵育，消除内源性过氧化物酶活性；滴加非免疫性动物血清室温孵育；滴加PSME1、PSME2、CDK15抗体（1∶200），4 ℃过夜。次日洗涤后，滴加二抗，37 ℃孵育；滴加链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶孵育；浓缩型二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，苏木精复染，脱水，树胶封片。用图像分析（Image-Pro Plus，IPP）软件分析图像，对细胞染色强度和着色百分比共同评定量化。

1.3.2 细胞培养及细胞转染

HEC-1B细胞用含10%磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，FBS）、RPMI-1640培养液，置于37 ℃、5%CO₂、90%湿度的细胞培养箱中培养，收集培养上清液进行下一步实验。将生长良好的细胞依照转染试剂说明转染细胞。将配置好的混合液Ⅰ（无酶水重悬siRNA干粉至浓度为100 µmol/L，加入基础培养基稀释siRNA浓度至20 µmol/L）和混合液Ⅱ（100 µL基础培养基+Lipo2000 2 µL）加在一起混合，轻轻摇匀，静置；将6孔细胞培养基的细胞加入其中，并加入基础培养基，使siRNA的终浓度为100 nmol/L；转染4~6 h，更换完全新鲜培养基。转染24~48 h，收取细胞，用于其他细胞功能实验。

1.3.3 实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测mRNA水平

按照TRIzol说明书提取子宫内膜组织的总RNA，然后按照反转录试剂盒说明书对提取的RNA进行逆转录。以cDNA为模板，分别检测PSME1/2、CDK15在癌旁正常细胞和EC组织中mRNA的表达水平。GAPDH为内参。引物序列PSME1上游5’-CCAGTGCCTGATCCAGTCAAG-3’，下游5’-ACCACGATCTTTTCATTGCAGT-3’；引物序列PSME2上游5’-GCAAGAGGACTCCCTCAATGT-3’，下游5’-CTTCTGGCTTAACCAGGGCA-3’；引物序列CDK15上游5’- TGGCCCAGTATATGTCTCAGC-3’，下游5’-GGCCCCGCAAAAGTTGAAAC-3’；基因内参上游5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，下游5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。Real-time PCR反应体系包括：SYBR Premix12.5 μL、引物（10 μmol/L）各1 μL、cDNA模板0.5 μL和ddH₂O 10 μL。Real-time PCR反应条件：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40个循环，再95 ℃ 10 s、65 ℃ 5 s、95 ℃ 5 s。目的基因结果用2^-ΔΔCt表示。

1.3.4 Western blot检测蛋白水平

根据蛋白提取试剂盒和BCA试剂盒说明书分别进行蛋白提取和蛋白浓度的测定。按照试剂比说明，配置分离胶、浓缩胶，按适当比例进行蛋白上样、电泳，将蛋白转移至聚偏氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上进行转膜后，放入5%脱脂牛奶中封闭，加入一抗，4 ℃孵育过夜。次日三羟甲基氨基甲烷缓冲液（tris buffered saline with tween，TBST）洗膜后室温下孵育二抗1 h，然后洗膜，用ECL试剂盒进行反应并拍摄。GAPDH为内参。

1.3.5 CCK8实验检测细胞的增殖活性

各组子宫内膜癌细胞培养36 h后，选取96孔板，每组均设置3个复孔，分别均匀的接种于96孔板中（6 000~9 000个/孔）。分别于每天的同一时间点（0 h、24 h、48 h和72 h）严格避光条件下对实验组和对照组加入10% CCK-8试剂10 µL，孵育3 h，用仪器检测每孔在波长450 nm下的吸光光度值（OD值），来反映细胞增殖的活性。

1.3.6 Transwell实验检测细胞的侵袭能力

将使用无血清培养基重悬的细胞悬液200 μL加入已铺基质胶的24孔transwell培养板上层小室中，向下层室中每孔加入完全培养基500 μL，孵箱中培养24~48 h。弃掉所有培养基，使用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）清洗培养板。下室每孔加入500 μL多聚甲醛，放入小室室温固定30 min，弃去甲醛，PBS清洗后晾干。再次向下室中加入500 μL结晶紫溶液，放入小室染色30 min，弃去溶液，PBS清洗干净，显微镜下观察计数。

1.4 统计学方法

采用SPSS 26.0进行统计分析，符合正态分布方差齐性的计量资料以均数±标准差（x±s）来表示，组间比较采用独立样本t检验；不符合正态分布的计量资料用中位数（四分位数）[M_d （P ₂₅，P ₇₅）]表示，采用秩和检验，计数资料采用例和百分比表示，两组比较采用卡方检验或Fisher精确检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 PSME1/2在EC组织中表达升高，CDK15表达下降

比较肿瘤组织与正常癌旁组织的表达情况，根据细胞染色强度和着色细胞百分比分为高表达组和低表达组。发现PSME1在98例EC患者肿瘤组织中高表达占85.7%（84/98），低表达占14.3%（14/98），癌旁正常组织不表达；PSME2在EC中高表达占51.0%（50/98），低表达占49.0%（48/98），癌旁正常组织不表达；CDK15在EC中高表达占36.7%（36/98），低表达占63.3%（62/98），癌旁正常组织呈高表达（图1）。结果表明，在EC癌组织PMSE1/2高表达，CDK15低表达。

2.2 PSME1/2与CDK15表达呈负相关

以人正常子宫内膜细胞系hEEC细胞系为对照，比较人EC细胞系HEC1B、HEC-251及原代细胞中PMSE1/2及CDK15在mRNA和蛋白表达水平。结果表明，与人正常子宫内膜细胞系相比，PMSE1/2 mRNA水平在人EC细胞系HEC1B及原代细胞中表达升高，在HEC-251细胞中表达量未见明显差异，在CDK15 mRNA表达水平在4组内无明显差异（图2A）。PMSE1/2蛋白在人EC细胞系HEC1B及原代细胞中表达量升高，而CDK15蛋白的表达量下降（图2B），提示PMSE1/2与CDK15的表达可能呈负相关关系，PMSE1/2作为一种蛋白酶体激活剂可能影响CDK15表达水平。

2.3 PSME1/2通过CDK15介导促进肿瘤细胞的增殖和侵袭

以高表达PSME1/2的HEC1B系使用siRNA建立PSME1/2敲低株以及PSME1/2和CDK15均敲低的双敲低株，并通过WB实验检测蛋白表达效果（图3A）。结果表明，与对照组相比，敲低PSME1/2后，PSME1/2表达下调，而CDK15的蛋白表达水平增高。双敲低株中PSME1/2和CDK15的表达均下调，提示PSME1/2表达可能与CDK15呈现负相关，且PSME1/2在CDK15在转录后水平起负调节作用。

CCK8细胞增殖实验和transwell实验结果表明，与对照组相比，仅敲低PSME1/2的HEC1B细胞的增殖能力和侵袭能力均下降；而在同时敲低PSME1/2及CDK15的HEC1B细胞中，HEC1B细胞受到抑制的增殖和侵袭能力获得了恢复（图3B、3C）。这表明PSME1/2的上调通过抑制CDK15蛋白的表达增强了肿瘤细胞的增殖和侵袭能力。

2.4 PSME1/2与CDK15的表达在EC病例中有相关性

根据患者EC标本PSME1/2、CDK15免疫表达情况，分为高表达组和低表达组，分析PSME1/2、CDK15表达与子宫内膜恶性肿瘤预后的影响。PSME1/2高表达组与低表达组与患者临床资料如年龄、术后诊断分型、分化程度、术后分期等差异无统计学意义（P>0.05）（表1）。CDK15低表达占PSME1高表达组的65.5%（55/84），占PSME2高表达组的46.0%（23/50），占PSME1/2高表达组的64.3%（63/91），占PSME1/2均高表达44.2%（19/43），提示PSME1和CDK15的表达呈负相关性（表2）。

2.5 PSME1/2、CDK15的表达与EC患者不良预后的关系

比较EC患者PSME1/2和CDK15表达情况对患者不良预后的影响（包括治疗期间疾病进展、疾病复发或因疾病死亡），采用Kaplan Meier方法和对数秩和检验，结果发现PSME1/2、CDK15的表达与EC患者的不良预后无明显相关性（P>0.05）（图4）。

比较PSME1/2高表达的患者中，CDK15的表达情况对患者不良预后的影响，采用Kaplan Meier方法和对数秩和检验，结果发现PSME2高表达的患者中，CDK15低表达的患者不良预后的比例较高，但差异无统计学意义（P>0.05），在PSME1高表达及PSME1/2均高表达的2组中，CDK15的表达对患者预后的影响差异也无统计学意义（P>0.05）（图5）。

3 讨论

EC作为女性妇科患者常见恶性肿瘤之一，起源于子宫内膜上皮细胞。近几年来EC发病率逐渐升高，可能与缺乏早期筛查手段有关^[13]。与组织的生物学标志物相比，基于血液的生物标志物获取较为便捷，如CA-125，可以反映治疗效果及提示患者复发^[14-15]。但到目前为止，预测性的生物标志物尚未被识别^[16]。在发展靶向治疗方面，EC几乎落后于每一种原发性癌症类型。肿瘤发生发展的核心离不开细胞周期调控，作为细胞周期的关键调节因子，CDKs（细胞周期蛋白依赖性激酶）与癌症发生密切相关。CDKs作为肿瘤治疗靶点早已有很多相关的研究，CDKs作为癌基因不仅在细胞调控周期中发挥着重要作用，而且在转录过程中也有极其重要的作用。有研究者发现，CDKs将成为乳腺癌和卵巢癌治疗新的靶点^[12]。而PSME基因在消化道恶性肿瘤（如胃癌、肝癌、结肠癌、直肠癌）、肺癌、甲状腺恶性肿瘤和妇科恶性肿瘤（如乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌）等多种肿瘤中均有表达，存在各种不同的通路促进肿瘤形成或抑制肿瘤发生发展的作用^[7]。在BC中，李胜男等^[12]实验证明PSME1/2有促肿瘤作用，而乳腺癌细胞中CDK15在蛋白水平和RNA水平表达不一致，而干扰CDK15能够增加乳腺癌细胞的侵袭和侵袭能力。与乳腺癌同为激素依赖性肿瘤的EC中，PSME1/2、CDK15提及甚少。

对98例患者EC标本的免疫组化结果分析PSME1/2、CDK15表达确实存在负相关性。而进一步的随访却未发现PSME1/2及CDK15的表达水平与患者的不良预后具有相关性，可能存在以下几种可能：①作为单中心样本可能因样本量过少而存在偏倚；②临床分期早、中期患者占比较高；③患者随访时间较短，欠缺长期随访结果；④PSME1/2-CDK15途径介导的对EC增殖和侵袭能力提高的途径并非存在于所有类型的子宫内膜癌患者中，该影响可能仅存在于某一类患者中，而其中的分类依据仍需进一步的研究发现。课题组将继续对患者进行随访，观察PSME1/2、CDK15的表达对患者长期预后的影响。

此外，有研究表明CDK15具有抑癌基因的作用^[12]。然而，本研究只证明PSME1/2在转录后水平对CDK15的抑制作用，其具体的作用机制以及CDK15在EC发展的过程中是否起到抑制作用尚需进一步研究。有研究通过组织型蛋白酶体抑制剂和免疫型蛋白酶体抑制剂诱导乳腺癌细胞后检测CDK15蛋白的表达^[12]，证明乳腺癌中使用了免疫型蛋白酶体抑制剂后不仅能使乳腺癌的侵袭和转移能力降低，同时CDK15蛋白表达也增加了，诠释CDK15抑制乳腺癌侵袭转移的上游调控机制。证实该通路可能在多种癌种中发挥作用，具有作为泛癌种靶点的潜质。

本研究发现在EC患者标本中，CDK15的表达与PSME1/2呈负相关关系。进一步的实验室研究发现，PSME1/2对CDK15的表达呈现负性调节，并通过实验表明PSME1/2通过抑制CDK15的蛋白表达促进了EC细胞的增殖和侵袭。这提示PSME1/2具有促EC作用，可能在肿瘤形成、进展、复发和转移过程中发挥重要的作用，PSME1/2作为新的肿瘤标志物及药物靶点具有潜在的可行性。但仍需要更多的实验来进一步探索PSME1/2、CDK15的相互影响过程以及在EC发生、发展和转移过程中的具体作用机制，为EC的早期筛查、诊断和治疗提供新方向和途径。

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基金资助

重庆市科卫联合医学科研资助项目(2021MSXM081)