乙酰辅酶A羧化酶2通过调控细胞周期促进肝癌细胞增殖

Promotion of the proliferation of hepatocellular carcinoma cells by acetyl-CoA carboxylase 2 through cell cycle regulation

摘要

目的 研究乙酰辅酶A羧化酶2（acetyl-co carboxylase 2，ACC2）对肝癌细胞增殖、迁移能力的影响以及其潜在的作用机制。 方法 通过TCGA、GEO、CPTAC数据库对ACC2在肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者肝脏组织中的表达和预后价值进行分析。采用CRISPR-Cas9系统构建了ACC2敲低肝癌细胞系，观察肝癌细胞增殖、迁移能力以及细胞周期的变化，Western blot实验检测细胞周期相关蛋白的表达。 结果 ACC2在肝癌组织中低表达（P<0.05）且与预后不良相关（P<0.05）。体外细胞功能学实验表明降低ACC2表达显著促进肝癌细胞增殖、迁移能力（P<0.05）。细胞周期流式分析显示敲低ACC2促进肝癌细胞周期G1/S期的转变（P<0.05），细胞周期相关蛋白中CyclinE2和p21的表达降低，而CyclinA2和p-RB的表达升高。 结论 ACC2可以促进肝癌细胞增殖和迁移的能力，对细胞增殖的促进作用是通过加速肝癌细胞周期G1向S期的转化实现的。

Abstract

Objective To investigate the impact of acetyl-CoA carboxylase 2（ACC2） on the proliferation and migration of hepatocellular carcinoma cells（HCCs） as well as the potential mechanism of action. Methods The expression of ACC2 in the liver tissue of patients with HCC and its prognostic significance were analyzed in The Cancer Genome Atlas， Gene Expression Omnibus，and Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium databases. The ACC2-knockdown cell lines of HCCs were established using the CRISPR-Cas9 system；the changes in proliferation，migration，and cell cycle of the HCCs were observed. The expression of cell cycle-related proteins was measured using Western blot assay. Results ACC2 showed low expression in the HCC tissue（P<0.05） and was associated with unfavorable prognoses（P<0.05）. In vitro cell functional experiments revealed that the decrease in ACC2 expression significantly enhanced the proliferation and migration of the HCCs（P<0.05）. Flow cytometric analysis of cell cycles proved that ACC2 knockdown promoted the G1/S phase transition（P<0.05），with decreased expression of CyclinE2 and p21 and increased expression of CyclinA2 and p-RB among the cell cycle-related proteins. Conclusion ACC2 promotes the proliferation and migration of HCCs，which is achieved by accelerating the G1-to-S phase transition of the HCCs.

关键词

肝癌 / 细胞增殖 / 细胞周期 / 乙酰辅酶A羧化酶2

Key words

hepatocellular carcinoma / cell proliferation / cell cycle / acetyl-COA carboxylase 2

肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一种恶性程度较高的肿瘤，我国原发性肝癌发病率和死亡率均高于全球平均值，每年死亡病例高达33.6万^[1]。HCC的高危因素主要包括HBV/HCV慢性感染、饮酒、肥胖等^[2]。近年来研究发现，代谢失调特别是脂质代谢异常可能在HCC的发生发展中起到重要的促进作用，但其具体机制尚未完全阐明^[3]。

乙酰辅酶A羧化酶2（acetyl-CoA carboxylase 2，ACC2）作为参与脂肪酸合成代谢的代谢酶之一，催化乙酰辅酶A转变为丙二酰辅酶A，在脂肪酸的合成中发挥关键作用^[4]。其编码基因为ACACB，位于人染色体12q24.11。ACC有2种亚型（ACC1和ACC2），ACC2主要位于线粒体的胞质表面，其代谢产物丙二酰辅酶A可以作为肉碱棕榈酰辅酶A 转移酶Ⅰ（carnitine palmitoyltransferase 1，CPT1）的抑制阻碍脂肪酸氧化。ACC2在肺癌中低表达^[5]，头颈癌中高表达^[6]，推测其表达可能具有器官特异性。研究发现，ACC2在不同组织来源的肿瘤中可能发挥抑癌或致癌基因的作用，例如乳腺癌中Snail对ACC2的转录抑制激活了CPT1依赖的脂肪酸氧化，促进乳腺癌的转移^[7]。单磷酸腺苷活化的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）在非小细胞肺癌中对ACC2的磷酸化修饰可以抑制其活性并达到促癌效果^[8]。但是ACC2的高表达促进头颈鳞状细胞癌恶性进展^[6]。目前ACC2在HCC发生发展中的作用无相关研究报道。

本研究首次发现HCC组织中ACC2明显低表达，且与预后不良相关，敲低ACC2促进肝癌细胞的增殖和迁移。初步机制研究发现，ACC2通过促进肝癌细胞周期进程来促进肝癌细胞的增殖。这一发现有望为研究HCC发生发展的机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞

人正常肝细胞系MIHA由香港理工大学柯子斌教授赠予，人肝癌细胞系HepG2、SK-Hep1、SNU449、PLC/PRF/5购自美国ATCC公司，人肝癌细胞系MHCC-97H、Huh7以及HEK293T细胞购自上海中国科学院细胞库。

1.2 试剂

DMEM培养基购于美国Gibco公司，胎牛血清购于阿根廷NTC公司，青霉素-链霉素购自美国MCE公司；转染试剂Lipo8000购自杭州碧云天生物技术有限公司。靶向ACC2的LentiCRISPR-sgACC2质粒购自苏州泓迅生物科技有限公司。BCA蛋白定量试剂盒购于杭州碧云天生物技术有限公司，PVDF膜购于美国Millipore公司，化学发光底物ECL购于美国Bio-rad公司。8 μm Transwell小室购自美国Corning公司；结晶紫染料购自北京索莱宝科技有限公司。ACC2抗体购自美国Boster公司（货号：A03668-2）；Rb抗体、p21抗体、CyclinA2抗体购自武汉ABclonal公司（货号：A16966、A1483、A19036）；β-actin抗体购自北京中山金桥生物技术有限公司（货号：TA-09）；CyclinE2抗体购自美国Bioworld公司（货号：BS65503）；p-Rb抗体购自英国Abcam公司（货号：ab184702）。细胞周期检测试剂盒购自苏州四正柏生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养

HEK293T细胞、Huh7细胞、PLC/PRF/5细胞均培养于DMEM培养基中（含10%胎牛血清和1%的青-链霉素），培养于37 ℃、5%CO₂细胞培养箱中。

1.3.2 慢病毒包装

实现ACC2的靶向敲低，我们通过Lipo8000转染试剂将包装质粒pMD2.G、psPAX以及LentiCRISPR-sgACC2这3种质粒以1∶2∶3的比例转染至HEK293T细胞，收集换液72 h后的细胞上清，感染肝癌细胞来靶向敲低肝癌细胞中ACC2的表达。

1.3.3 Western blot实验

用细胞裂解液提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后，进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳完成后，通过湿转法将蛋白转印到PVDF膜上，脱脂牛奶室温封闭1.5 h后孵育一抗，4 ℃孵育12 h。一抗孵育完成后，TBST缓冲液洗膜，室温孵育二抗1.5 h，再次洗膜后进行ECL显影。

1.3.4 细胞增殖实验

将PLC/PRF/5细胞和Huh7细胞铺于96孔板中，密度分别为1×10³ 个/孔和1.5×10³个/孔，待细胞贴壁后于Incucyte ZOOM活细胞成像仪中拍摄记录第1天的细胞图像并每隔24 h拍摄1次，持续5 d，根据细胞底面积计算细胞数量并绘制生长曲线。

1.3.5 克隆形成实验

将PLC/PRF/5细胞（1×10³ 个/孔）、Huh7细胞（1.5×10³ 个/孔）铺于6孔板中，正常培养10 d左右，直至细胞长出肉眼可见的细胞集落后，4%多聚甲醛室温固定细胞30 min，结晶紫染色5 min，最后拍照并计数细胞克隆数。

1.3.6 Transwell实验

使用8 μm transwell小室进行实验，将3×10⁴个PLC/PRF/5细胞和Huh7细胞分别培养在无血清培养基的小室内，小室外加入含10%胎牛血清的培养基。培养24 h后取出，用4%多聚甲醛室温固定小室30 min后结晶紫染色5 min，清洗小室并将小室内部的细胞拭去后于显微镜下拍照记录，随机选取5个区域进行细胞计数。

1.3.7 划痕实验

将密度为90%的PLC/PRF/5细胞和Huh7细胞铺于96孔板中，待细胞贴壁并形成均匀单层细胞后，使用划痕器划痕，分别于划痕后0 h和24 h在Incucyte ZOOM活细胞成像仪中拍摄细胞图像，计算细胞迁移率。

1.3.8 流式细胞术细胞周期分析

在6 cm培养皿中培养细胞，待细胞贴壁后使用无血清培养基饥饿细胞12 h使细胞周期同步，常规情况下培养36 h后消化细胞并收集细胞沉淀，随后4 ℃下用75%乙醇固定细胞12 h，固定完毕使用碘化丙啶在37 ℃染色30 min，染色完毕后流式细胞术上机检测，利用Modfit 4.1软件对细胞周期曲线进行分析和拟合。

1.3.9 数据库分析

The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库（https://www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing/tcga）下载肝癌（TCGA-LICH）数据集，用R语言分析ACACB mRNA在肝癌及正常肝组织中的表达差异和生存分析。Gene Expression Omnibus（GEO）数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中获取HCC转录组数据集GSE6764，并使用R语言分析ACACB mRNA在HCC不同阶段的表达。使用蛋白数据库Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium（CPTAC）在线工具cProSite（https://proteomics.cancer.gov/data-portal）分析ACC2蛋白在肝癌及癌旁组织中的表达情况。

1.4 统计学方法

统计学分析采用Graphpad Prism 8软件进行，计量资料以均数±标准差（x±s）的形式呈现。两组数据比较采用两独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。数据来自至少3个独立重复实验的结果。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 ACC2在肝癌中低表达且预后不良相关

据TCGA数据库分析结果显示，ACACB在肝癌组织中的转录水平较正常肝组织显著下降（正常组织：4.44±0.55，肿瘤组织：3.76±1.01，P<0.001，图1A），ACACB低表达与肝癌患者较差的总体生存率密切相关（P=0.023，图1B）。GEO数据集GSE6764的分析结果显示，肝癌组织中ACACB mRNA水平明显低于正常肝组织，且随着肝癌的不同发展阶段，正常肝组织、纤维化肝组织、早期肝癌和晚期肝癌组织中ACACB mRNA水平呈梯度下降（a：9.64±1.02，b：5.55±0.79，c：5.12±1.18，d：2.80±0.40，e：2.70±0.67，f：1.77±0.32，P<0.01，图1C）。蛋白表达数据库CPTAC中的分析结果也表明，ACC2蛋白在肝癌组织中的表达显著低于癌旁组织（癌旁组织：0.42±0.40，肿瘤组织：-0.90±0.77，P<0.001，图1D）。上述研究结果表明，HCC组织中的ACC2水平更低，其表达与肝癌的恶性程度负相关。

2.2 构建ACC2敲低肝癌细胞系

本研究在肝癌细胞系中检测内源性ACC2的表达水平，Western blot结果显示肝癌细胞系ACC2的表达均低于正常肝细胞MIHA细胞，相较之下PLC/PRF/5细胞和Huh7细胞中ACC2的表达水平最高，而SNU449、MHCC-97H细胞中ACC2表达水平最低（图2A）。于是通过CRISPR-Cas9系统，选择ACC2表达水平最高的2个细胞系PLC/PRF/5和Huh7构建了ACC2靶向敲低细胞模型（图2B），并在后续实验中采用敲低细胞模型观察ACC2对肝癌细胞生物学行为的影响。

2.3 敲低ACC2促进肝癌细胞增殖

细胞增殖实验结果显示细胞在体外正常培养5 d，相较于sgCtrl组（Huh7：8.31±0.39；PLC/PRF/5：8.30±0.23），sgACC2-1（Huh7：12.36±0.40，P<0.001；PLC/PRF/5：12.23±0.41，P<0.001）和sgACC2-2（Huh7：13.33±0.34，P<0.001；PLC/PRF/5：12.80±0.66，P<0.001）组的细胞增殖能力明显提高（图3A）。克隆形成实验也显示，相较于sgCtrl组（Huh7：257.30±11.24；PLC/PRF/5：97.33±15.50），sgACC2-1组（Huh7：320.00±22.11，P=0.008；PLC/PRF/5：185.30±20.60，P=0.001）和sgACC2-2组（Huh7：357.00±17.35，P<0.001；PLC/PRF/5：184.30±10.97，P=0.001）的克隆形成能力更强（图3B）。该部分结果表明，敲低ACC2促进肝癌细胞增殖。

2.4 敲低ACC2促进肝癌细胞迁移能力

为了观察ACC2水平敲低对肝癌细胞迁移能力的影响，通过划痕实验和Transwll实验检测肝癌细胞的体外迁移能力。划痕实验结果显示，sgACC2-1组（Huh7：48.93±4.42，P<0.001；PLC/PRF/5：41.62±1.84，P<0.001）和sgACC2-2组（Huh7：54.49±3.81，P<0.001；PLC/PRF/5：44.25±2.80，P<0.001）的细胞迁移能力显著高于sgCtrl组（Huh7：25.38±2.73；PLC/PRF/5：26.90±1.31）（图4A）。Transwll实验也表明，相较于sgCtrl组（Huh7：49.00±4.93；PLC/PRF/5：31.00±4.73），sgACC2-1组（Huh7：67.00±3.00，P=0.002；PLC/PRF/5：55.00±3.61，P<0.001）和sgACC2-2组（Huh7：73.00±6.08，P=0.008；PLC/PRF/5：61.00±3.61，P=0.001）的细胞具有更强的迁移能力（图4B）。结果表明，敲低ACC2促进肝癌细胞迁移能力。

2.5 敲低ACC2促进肝癌细胞周期

为了探索敲低ACC2促进肝癌细胞增殖的具体机制，我们通过流式细胞术检测了细胞周期的变化。实验发现敲低ACC2后肝癌细胞G1期减少（Huh7-sgACC2-1：38.06±0.15，P<0.001；Huh7-sgACC2：37.29±0.29，P<0.001；PLC/PRF/5-sgACC2-1：38.98±0.78，P<0.001；PLC/PRF/5-sgACC2-2：38.82±0.67，P<0.001），S期增多（Huh7-sgACC2-1：53.33±0.50，P<0.001；Huh7-sgACC2：54.29±0.55，P<0.001；PLC/PRF/5-sgACC2-1：45.59±0.33，P<0.001；PLC/PRF/5-sgACC2-2：45.42±0.69，P<0.001），促进了细胞周期检查点G1/S的转换（图5A）。对细胞周期相关蛋白表达的检测也发现，敲低ACC2后细胞周期抑制蛋白p21表达下降，p-Rb表达升高，G1期周期特征性蛋白Cyclin E2表达减弱而S期周期蛋白Cyclin A2表达增强（图5B），这些变化都提示敲低ACC2后通过促进细胞周期由G1向S期转换，促进肝癌细胞的增殖。

3 讨论

脂肪酸是构成细胞膜的主要成分，也是能量存储和细胞信号传递的重要分子^[9]。近年来研究发现，脂肪酸代谢异常通过对多种关键分子和信号通路的调控，参与HCC发生与发展。首先，脂肪酸代谢可以调控HCC进展的信号通路活化。例如，ATP柠檬酸裂解酶(ATP citrate lyase，ACLY)是脂肪酸从头合成的第一步，可以通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进肝癌细胞的干性、迁移和侵袭^[10]。脂肪酸转运蛋白5（fatty acid transport protein-5，FATP5）通过促进ATP的产生抑制AMPK活性，进一步激活下游mTOR以支持HCC的进展和转移^[11]。此外，脂肪酸代谢途径产生的代谢物还可以直接作为信号分子调控HCC进程。溶血磷脂酸（phospholipids，LPC）是PI3K/AKT、mTOR和MAPK信号通路的重要调控分子，可以增强肝癌细胞的迁移、侵袭和黏附^[12]。油酸处理也可以直接激活FABP5/HIF-1α轴，从而促进肝癌细胞的脂质积累和细胞增殖^[13]。脂肪酸代谢还能通过对肿瘤微环境的调控抑制免疫细胞杀伤功能，促进肿瘤细胞的免疫逃逸。例如肿瘤组织中的Treg细胞可以通过SREBP依赖的脂质从头合成来维持肿瘤微环境中Treg细胞的功能状态，阻碍机体抗肿瘤免疫^[14]。

鉴于脂肪酸代谢异常参与多种肿瘤包括HCC的发生发展过程，靶向脂肪酸代谢的抑制剂可能具有一定的抑癌作用。脂肪酸合酶（fatty acid synthase，FASN）抑制剂奥利司他在体外和小鼠肝癌模型中均表现出良好的抗肿瘤活性^[15-16]，该酶抑制剂C75^[17]，triclosan21^[18]和EGCG^[19]在体外也具有抑癌效果。硬脂酰辅酶A去饱和酶1（stearoyl-CoA desaturase-1，SCD1）抑制剂CAY10566也成功地改善体内外的肝癌进展^[20-22]。提示靶向脂肪酸代谢的新型抑制剂可以为肝癌的靶向治疗提供新的策略。

ACC催化乙酰辅酶A 羧化为丙二酰辅酶A的酶促反应过程，是脂肪酸合成途径的主要限速步骤。有研究发现，在DEN/CCl₄诱导的小鼠肝癌模型中，抑制ACC1/2的活性可显著降低小鼠肝癌模型的肿瘤进展^[23]。并且，肝脏特异性抑制剂ND-654可以通过模拟ACC1/2的磷酸化阻断其活性，抑制HCC的进展^[24]。但在DEN/CCl₄诱导的小鼠肝癌模型中肝脏特异性ACC1/2基因敲除反而导致肿瘤细胞显著增加^[24]。有研究发现，ACC1在HCC中高表达并促进肝癌发生发展^[25]，但ACC2在HCC中的作用机制仍然未知。本研究通过多个数据库的分析发现肝癌组织中ACC2的表达在转录和蛋白水平均低于正常肝组织，且与预后不良相关。体外实验发现敲低ACC2可以明显促进肝癌细胞的增殖和转移。

细胞周期失调是导致恶性肿瘤异常增殖的关键因素。G₁/S期以及G₂/M期2个细胞周期调控点的失控会直接导致肿瘤细胞的异常增殖^[26]。研究表明，多种代谢途径可以参与调控细胞周期进程，如丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2，PKM2）在G₁期可以发生核转位，通过cMyc/β-catenin轴激活周期蛋白CyclinD的转录^[27-28]。6-磷酸果糖-2-激酶（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2，6-biphosphatase，PFKFB）通常在G₁期晚期被激活，在营养限制期促进糖酵解，从而有利于G₁/S期的转换^[29]。结果显示，敲低ACC2后促进了肝癌细胞周期G₁期向S期的转换，进而增强肝癌细胞的增殖能力。

本研究发现HCC中ACC2低表达，且其表达与HCC预后不良相关。敲低ACC2使肝癌细胞的增殖、迁移能力得到明显的增强。初步机制研究发现，ACC2对肝癌细胞增殖的促进作用是通过促进G1/S期转换实现的。今后将在临床样本中验证ACC2的表达情况，并进一步探索ACC2促进肝癌细胞周期转换的具体机制。

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基金资助

国家自然科学基金资助项目(82072286)

国家自然科学基金资助项目(82272975)

重庆市教委科学技术研究计划资助项目(KJZD-M202000401)