硫酸软骨素蛋白多糖在脊髓损伤中的研究进展

Research progress of chondroitin sulfate proteoglycans in spinal cord injury

摘要

硫酸软骨素蛋白多糖（chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs）是中枢神经系统细胞外基质的组成部分，在中枢神经系统发育、正常维持及病理过程中都发挥着关键的作用。脊髓损伤后，损伤部位CSPGs的表达明显上调，这主要源于病变部位活化的星形胶质细胞。CSPGs的上调会限制脊髓损伤部位的轴突再生、传导和再髓鞘化，并且可以促进脊髓损伤中的炎症反应，不利于脊髓损伤后神经功能恢复。因此，抑制CSPGs可能是促进脊髓损伤后轴突再生和功能恢复的有效治疗方法。本文对CSPGs在脊髓损伤中的研究现状进行综述。

Abstract

Chondroitin sulfate proteoglycans（CSPGs） are components of the extracellular matrix of the central nervous system，and play key roles in the development，function maintenance，and pathological process of the central nervous system. After spinal cord injury，the expression of CSPGs at the injury site is significantly upregulated，which is mainly due to activated astrocytes at the lesion site. Upregulation of CSPGs can restrict axon regeneration，conduction，and re-myelination at the site of spinal cord injury，and can promote the inflammatory response in spinal cord injury，which impedes the recovery of nerve function after spinal cord injury. Therefore，inhibition of CSPGs may be an effective treatment to promote axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. This study reviews the current status of research on CSPGs in spinal cord injury.

关键词

硫酸软骨素蛋白多糖 / 脊髓损伤 / 糖胺聚糖 / 神经修复

Key words

chondroitin sulfate proteoglycan / spinal cord injury / glycosaminoglycan / nerve repair

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是由创伤或非创伤致病因素导致的脊髓结构与功能的破坏，而促进神经组织再生和恢复神经元连接仍是现代医学面临的最大挑战之一^[1]。SCI后病变部位出现血管破坏和缺血，引发神经胶质细胞活化、神经炎症和氧化应激，这些急性期变化导致细胞死亡、轴突损伤、基质重塑和胶质瘢痕的形成^[2]。损伤脊髓中的多种细胞共同作用形成胶质瘢痕，包括激活的星形胶质细胞、少突胶质前体细胞、小胶质细胞、成纤维细胞和周细胞，胶质瘢痕可以限制神经炎症向邻近脊髓组织扩散；同时，神经胶质瘢痕中的反应性星形胶质细胞和其他细胞都会上调硫酸软骨素蛋白多糖（chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs）的表达^[3-4]。在SCI的亚急性和慢性阶段，成熟的胶质瘢痕和上调的CSPGs成为抑制轴突再生和细胞分化的因素^[5]。神经胶质瘢痕是阻碍脊髓损伤修复的物理屏障和化学屏障，其抑制性主要归因于高浓度的抑制蛋白，包括CSPGs和髓鞘蛋白，限制轴突再生和运动感觉功能的恢复^[6-7]。因此，SCI修复愈合的策略之一是降低CSPGs的抑制作用。目前已有众多关于CSPGs在SCI病理生理及治疗中的研究报道，本文对其最新研究进展进行综述。

1 CSPGs的组成及其在中枢神经系统中的作用

1.1 CSPGs家族

蛋白聚糖是细胞外基质的主要组分之一，由核心蛋白和糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）共价结合形成。存在于人体内的GAG包括透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质、肝素和硫酸肝素，GAG链多是由氨基己糖和己糖醛酸构成的双糖单位重复连接形成，软骨素磺基转移酶可将硫酸盐添加到GAG链的特定位置，GAG的硫酸化增加了蛋白聚糖的结构复杂性^[8]。GAG链通过糖苷键连接到核心蛋白上形成蛋白聚糖，硫酸软骨素以O-糖苷键与蛋白质链上丝氨酸残基结合形成CSPGs。CSPGs家族主要包括lecticans、富含亮氨酸的小蛋白聚糖（small leucine-rich proteoglycans，SLRPs）、磷酸酶蛋白聚糖（phosphacan）和神经胶质抗原2（neuron-glial antigen 2，NG2）^[6]。Lecticans家族包括聚集蛋白聚糖（aggrecan）、短蛋白聚糖（brevican）、神经蛋白聚糖（neurocan）和多能聚糖（versican），它们的结构相似，N端为透明质酸结合结构域，C端为球状结构域，可与其他基质蛋白结合^[9-10]。在中枢神经系统细胞外基质中，aggrecan通过与连接蛋白和肌腱蛋白相互作用，将透明质酸结合到细胞表面^[11]。brevican和neurocan是中枢神经系统中含量最丰富的CSPGs，brevican是细胞外基质中神经元周围网（perineuronal nets，PNN）的关键成分，神经胶质细胞和神经元都会分泌brevican，其在突触的稳定和控制突触活动方面发挥着重要作用^[12]。neurocan在胚胎发育过程中高表达，并在神经细胞迁移、神经元突起生长和调节突触可塑性等过程中发挥作用^[13]。versican作为结构大分子，分布于成人体内的上皮组织、疏松结缔组织、软骨膜、平滑肌细胞和神经组织中，在发育过程中以及炎症等病理条件下versican会瞬时高水平表达，炎症早期阶段，versican在活化的成纤维细胞、内皮细胞和浸润的巨噬细胞中表达，versican可能通过与透明质酸结合或介导细胞因子的信号传导来调节炎症^[14]。NG2和phosphacan不同于lecticans的结构，phosphacan是受体型酪氨酸磷酸酶β的胞外结构域；NG2是一种跨膜CSPGs，在人类中也称为CSPG4，主要由少突胶质前体细胞、小胶质细胞、巨噬细胞和周细胞表达，星形胶质细胞不表达^[9]。增殖的NG2阳性周细胞参与SCI病灶区域血管生成和纤维化瘢痕形成，NG2胶质细胞在SCI后也会增殖，并在胶质瘢痕中大量聚集^[15]。SLRPs的核心蛋白由富含亮氨酸的重复序列组成，广泛存在于细胞外基质中，研究认为SLRP通过改变组织力学和结构来阻止轴突再生，并确定 SLRP富集是人类大脑和脊髓病变的一个特征^[16]。

1.2 CSPGs在中枢神经系统中的作用

CSPGs是中枢神经系统细胞外基质的组成部分，在大脑和脊髓的发育和正常生理过程中起着重要作用。CSPGs的核心蛋白对其生物活性方面的影响较小，而附着在核心蛋白上的GAG则是其主要功能成分^[17-18]。PNN是环绕在许多神经元细胞体周围并随树突延伸的网状结构，是一种独特的细胞外基质结构，在神经发育、突触发生和调控神经系统可塑性方面发挥着关键作用，CSPGs参与形成PNN，CSPGs和PNN调节出生后神经发育中关键期的开启和关闭^[19]。研究发现，降解CSPGs破坏了PNN的结构，导致视觉皮层发育的关键期重新开启并激活神经可塑性^[20]。进一步研究发现，关键期的关闭与PNN的形成及CSPGs的硫酸化模式有关，表现为关闭时4-硫酸软骨素与6-硫酸软骨素的比率增加^[21]。在整个大脑发育过程中，CSPGs的表达水平逐渐降低，当中枢神经系统受到严重损伤后其表达量开始上调^[7]。CSPGs和硫酸肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPGs）的GAG链都可以与轴突生长锥上的受体蛋白酪氨酸磷酸酶σ（receptor protein tyrosine phosphataseσ，RPTPσ）结合，HSPGs促进轴突生长，而CSPGs抑制轴突生长^[22]。CSPGs和其他蛋白多糖的适当平衡是神经元发育的关键。此外，CSPGs的表达对中枢神经系统的神经元迁移和突触稳定具有重要作用。在大脑发育中，neurocan、versican和phosphacan在纹状体、边缘区等部位大量表达，调节兴奋性和抑制性神经元的迁移，并且发现，编码核心蛋白和GAG合成及修饰酶的基因与多种精神和智力障碍有关，导致发病的原因可能涉及神经元迁移缺陷^[23]。对基因敲除突变小鼠进行研究，这种小鼠突变体缺乏四种细胞外基质成分brevican、neurocan以及糖蛋白tenascin-C和tenascin-R，使用共培养系统培养原代胚胎海马神经元和星形胶质细胞，在突变星形胶质细胞存在的条件下培养神经元两周后显示出突触数量增加，而经过3周或更长时间后，突触的形成和稳定均受到影响^[24]。

CSPGs参与中枢神经系统的病理过程。中枢神经系统损伤后，受损部位形成胶质瘢痕，神经胶质瘢痕边界的形成可以隔离神经损伤，并分泌大量CSPGs、胶原和致密的细胞外基质，这有利于保护周围的正常组织，但不利于神经组织再生^[3，25]。Snow DM等^[26]首次观察到条带试验中小鸡胚胎背根节神经元优先在层粘连蛋白条带上生长，而避开含有CSPGs的条带。这说明CSPGs能有效地抑制轴突再生。此外，CSPGs通过限制少突胶质前体细胞的成熟，并促使神经干细胞向星形胶质细胞转变，从而阻止少突胶质细胞的成熟和再髓鞘化过程^[6，27]。CSPGs和PNN的异常与神经退行性疾病的病理相关。在阿尔茨海默病的研究中发现，PNN包裹的神经元避免了神经纤维缠结，其对神经元具有保护作用^[28]。CSPGs是PNN的组成部分，对调节其神经保护功能至关重要，阻断抑制性CSPGs可改善阿尔茨海默病小鼠模型的物体识别能力^[29]。此外，相关研究表明CSPGs与双相情感障碍、精神分裂症、孤独症、抑郁、焦虑和癫痫等疾病有关^[30]。

2 CSPGs在SCI中的表达及作用

2.1 CSPGs在SCI后表达上调

SCI后24 h内病灶处CSPGs的表达开始上调，上调的CSPGs包括neurocan、brevican、versican和NG2，于2周后达到峰值并长期保持上调水平，不同类型的细胞会表达不同的CSPGs^[9，31]。SCI局部和损伤区域远端的NG2和lecticans表达均增加，脊髓损伤区域远端的组织学变化不明显，但细胞外蛋白聚糖发生明显变化，甚至持续至SCI后30 d^[32]。病变周围特定CSPGs的分布各不相同，neurocan和brevican在病灶附近表达，而phosphacan和versican则在较远的地方表达^[5，33]。抑制性CSPGs主要由损伤组织中的星形胶质细胞大量合成，并沉积在细胞外基质中^[31]。SCI后，病变周围的星形胶质细胞出现反应，表现为细胞肥大、突起延长和胶质纤维酸性蛋白表达增加，在损伤后1周表现出反应性星形胶质细胞（reactive astrocytes，RAs）的典型形态；在损伤后2周，损伤区周围的星形胶质细胞转化为瘢痕形成星形胶质细胞（scar-forming astrocytes，SAs），并参与形成胶质瘢痕^[34]。研究表明，SAs中的CSPGs相关基因Xylt1、Csgalanact1、Pcan 和 Slit2的表达量明显高于幼稚星形胶质细胞和RAs，而与损伤后2周的SAs相比，损伤后12周的慢性期星形胶质细胞中的Csgalanact1和Pcan的表达明显降低^[35-36]。因此，损伤后12周时CSPGs的表达相对较低。创伤性SCI后受损部位血管破坏和出血会使瘢痕形成细胞暴露于血浆中的因子，如纤维蛋白原。Schachtrup C等^[37]研究发现纤维蛋白原通过TGFβ/Smad2信号通路诱导星形胶质细胞表达CSPGs。Susarla BT等^[18]的研究发现TGF-β诱导星形胶质细胞中CSPGs的表达是依赖Smad的，不同类别CSPGs的合成机制对Smad2和Smad3的依赖性不同。而另1项研究发现，TGFβ通过不依赖Smad的途径诱导星形胶质细胞产生CSPGs，使用siRNA敲除Smad2或Smad4基因后CSPGs的表达明显上调，CSPGs的上调是由PI3K/Akt/mTOR轴介导的^[38]。还需要进一步的研究来验证SCI后诱导星形胶质细胞合成CSPGs的具体机制。

2.2 CSPGs抑制SCI后的功能恢复

SCI后，CSPGs可以特异性地抑制神经元的突起生长，同时抑制轴突传导和再髓鞘化过程，并可以促进SCI后的炎症反应，从而对神经功能恢复产生不利影响。Petrosyan HA等^[39]研究发现，长期输注NG2单克隆抗体可以改善SCI大鼠的轴突传导性和兴奋性，增加脊髓血清素轴突密度，改善运动功能，并发现NG2可以通过调节Na⁺通道直接阻止轴突传导。SCI后，成熟的少突胶质细胞大量死亡，少突胶质细胞的再生可以保护轴突的完整性和促进损伤脊髓白质修复，而 CSPGs可直接诱导神经干细胞和少突胶质细胞祖细胞凋亡，并抑制神经干细胞和少突胶质前体细胞分化、成熟和髓鞘化的能力^[40]。研究发现，从神经干细胞衍生的少突胶质细胞中去除GAG可加速其形态成熟^[41]。

CSPGs参与调节SCI中的免疫反应，并通过促进SCI中的炎症反应来限制内源性修复^[42]。CSPGs整合来自微环境的信号并激活免疫细胞，通过结合toll样受体、选择素、CD44和β1整合素等免疫受体促进炎症反应，还能结合免疫细胞的信号分子并激活基质降解酶^[8]。Rolls A等^[43]发现SCI后CSPGs参与调节巨噬细胞/小胶质细胞的活化和在病变部位的空间定位，并发现损伤后立即抑制CSPGs的形成会促进炎症反应，损伤2 d后处理CSPGs则有利于功能恢复。在早期阶段，CSPG激活小胶质细胞和巨噬细胞，并可能通过建立胶质瘢痕屏障来限制损伤部位的扩大，这似乎对SCI修复是有利的，而在慢性阶段或当CSPG高表达时，则会抑制轴突再生。最近1项研究表明，脊髓损伤部位的CSPGs通过TLR4介导在免疫反应的多个阶段发挥着关键作用，其激活固有免疫细胞进入促炎状态，并促进适应性免疫细胞的浸润，还会阻止M1型免疫细胞向M2转化，使炎症持续存在^[44]。

2.3 参与介导CSPGs作用的受体

研究发现，CSPGs的糖胺聚糖残基可以与多种神经发育抑制性受体相互作用，如Nogo受体家族成员NgR1和NgR3、RPTPσ和白细胞共同抗原相关磷酸酶受体（leukocyte common antigen-related phosphatase receptor，LAR），CSPGs与这些受体作用可以抑制轴突再生^[45-46]。SCI后，当神经元生长锥与CSPGs等抑制性分子接触时，相应的抑制性受体会被激活，从而启动与细胞骨架动力学有关的下游信号通路。目前关于RhoA/ROCK通路的研究比较深入。Rho蛋白家族是一组GTP结合蛋白，相对分子量约为20~30 kD，在调节神经元生长锥、神经元突起和神经元发育方面发挥重要作用^[47]。SCI后RhoA的表达明显增加，RhoA/ROCK激活时通过阻止微管招募，促进生长锥中纤维状肌动蛋白解体，从而阻碍轴突的伸长，最终导致生长锥塌陷^[48-49]。另有研究发现，CSPG作用于RPTPσ和LAR不仅可以激活RhoA/ROCK信号，同时使Akt和Erk通路失活，并且2种受体在上述信号通路的下游采取不同途径，以实现CSPGs对轴突生长的抑制作用^[50]。LAR和RPTPσ参与介导CSPGs对神经干细胞、少突胶质前体细胞和神经元等多种细胞类型的作用，对这些受体进行抑制处理可以限制CSPGs的影响^[4]。

3 CSPGs在SCI治疗中的作用

SCI后，损伤微环境中CSPGs的沉积是阻碍神经修复的重要因素，其也成为SCI治疗的重要靶点。通过酶解GAG链清除CSPGs，减少CSPGs的合成和阻断CSPGs受体，都会在不同实验条件下引起轴突再生和再髓鞘化，有利于SCI后的修复。SCI是一个渐进而复杂的病理过程，涉及多种细胞类型、细胞反应和生物过程，目前的一些研究采用多种策略相结合以减轻CSPGs的抑制作用，从而增强治疗效果。

3.1 酶解CSPGs

软骨素酶ABC（chondroitinase ABC，ChABC）是一种裂解酶，ChABC具有内切酶和外切酶两种亚型，内切酶消化CSPGs的硫酸化GAG链，外切酶将释放的多糖降解为二糖^[51]。用ChABC降解GAG链可以促进轴突再生，并改善各种中枢神经系统损伤模型的行为。Barritt AW等^[52]研究发现，大鼠颈部脊髓损伤后用ChABC处理可诱导变性和去神经支配区域的皮质脊髓束、5-羟色胺能和初级传入纤维出芽，因此认为促进脊髓轴突出芽需要降解CSPGs。Hu JL等^[53]在灯鱼脊髓横切模型中研究发现，ChABC降解CSPGs不仅能增强SCI后的轴突再生，还能抑制逆行性网状脊髓神经元凋亡信号的传导。然而，由于CSPGs在SCI后神经再生中的复杂作用，全面消耗CSPGs似乎并不是一个可行的选择^[54]。研究发现，CSPGs在小鼠SCI后的急性期发挥着关键作用，损伤后立即抑制CSPGs的合成会影响运动功能恢复，并增加组织损失，而延迟抑制CSPGs可改善功能恢复^[43]。这说明SCI后可能需谨慎选择降解CSPGs的时机和程度。

由酶介导的CSPGs降解疗法面临的问题是ChABC的热不稳定性和缺乏作用的持续性^[51]。为了提高疗效，设计高效、多功能的生物辅助材料和改进ChABC的输送可能是有效的解决办法。1项研究发现，发生定点突变和聚乙二醇链共价修饰的PEG-N1000G-ChABC稳定性高、功能半衰期延长，通过甲基纤维素水凝胶输送该蛋白，可以实现其局部亲和控制释放，在动物实验中更高效地降解CSPG^[55]。目前，病毒载体递送ChABC可能成为有效的治疗方法，通过使用慢病毒和腺相关病毒载体对酶的表达和活性进行时间调控，由于转导细胞会不断合成软骨素酶，一次性注射就能实现ChABC的持续释放^[56]。此前大量研究都证明了ChABC用于治疗SCI的有效性，目前的研究致力于如何将ChABC更高效准确地用于SCI的治疗。

3.2 减少CSPGs合成

CSPGs由核心蛋白和附着硫酸盐的GAG侧链组成，在SCI急性期抑制GAG的生物合成有望成为促进神经功能恢复的有效方法。硫酸软骨素是由15种以上的酶合成的，抑制这些酶的合成将减少CSPGs的表达；CSGalNAcT1（T1）是其中一种酶，T1基因敲除小鼠在SCI后表现出广泛的轴突再生^[57]。软骨素磺基转移酶15（chondroitin sulfotransferase 15，Chst15）参与硫酸软骨素的合成，在大鼠横断脊髓组织中施用Chst15抑制剂可有效促进运动功能恢复和神经组织再生^[58]。另1项研究发现，用2-花生四烯酸甘油（2-arachidonoylglycerol，2-AG）或其水解酶抑制剂处理可以下调活化星形胶质细胞CSPGs的表达，并且2-AG可直接促进CSPGs抑制条件下的少突胶质细胞的分化^[31]。物理治疗也被用于减少CSPGs合成的研究中。Zhang ZH等^[59]研究发现以50毫瓦/平方厘米的功率密度照射小鼠的脊髓损伤部位，可以下调SCI中CSPGs的表达，小鼠的运动功能得到有效恢复，而versican是光生物调制的关键靶分子之一，MAPK/Sox9和Smad3/Sox9通路可能在该过程中发挥作用。对大鼠SCI模型进行水跑步机训练，能有效降低SCI后星形胶质细胞的活化和损伤周围CSPGs的表达水平，并抑制脊髓损伤后神经元NgR/RhoA/ROCK信号通路的激活^[47]。

3.3 抑制CSPGs相关受体

通过抑制CSPGs的相关受体可以形成有利于轴突再生和神经功能恢复的微环境。目前已开发出LAR和RPTPσ的抑制剂ILP和ISP，阻断LAR和RPTPσ可使SCI后M2型小胶质细胞/巨噬细胞和调节性T细胞数量增加，可促进少突胶质前体细胞形成，并减轻Caspase 3介导的成熟少突胶质细胞死亡，形成有利于损伤修复的微环境^[40，42]。近期研究还发现，抑制CSPG/LAR/PTPσ轴可促进SCI后移植神经干细胞的分化成熟，进而有利于损伤后修复^[60]。CSPGs通过LAR和RPTPσ受体激活细胞内RhoA/ROCK通路，阻碍轴突生长和再生。Dubreuil CI等^[61]研究发现，阻断SCI后Rho的过度激活可以保护神经细胞免于p75NTR依赖性凋亡。体外实验表明，RPTPσ缺失的小鼠小脑颗粒神经元对CSPGs抑制作用的敏感性降低，这可能有助于皮质脊髓束轴突穿过富含CSPGs的神经胶质瘢痕^[62]。在删除编码RPTPσ和LAR基因的小脑颗粒神经元原代培养物中，会出现轴突生长的叠加增强效应^[50]。总之，RPTPσ和LAR是介导CSPGs对轴突抑制作用的重要靶点，拮抗相应受体将成为SCI后促进修复的有效方法。

3.4 针对CSPGs的其他SCI治疗方法

当前，大量研究使用新型的基于生物材料的递送系统或者生物载体，将抑制CSPGs的相关因子传递至脊髓损伤部位，从而促进损伤后功能恢复。Sun XM等^[54]使用功能性自组装肽（functional self-assembling peptide，F-SAP）水凝胶来连接大鼠SCI后横断的病灶，F-SAP水凝胶由纳米纤维网络组成，负载有ISP和ILP，两者分别是RPTPσ和LAR的拮抗剂，以此阻断CSPGs的信号传导；与负载ChABC的F-SAP水凝胶相比，负载ISP和ILP的F-SAP水凝胶促进抗炎反应，形成有利于轴突再生和突触形成的微环境。Epac2的激活能促进SCI后的轴突生长，并能抑制活化星形胶质细胞和CSPGs，使用基于生物材料的水凝胶系统局部递送Epac2激动剂，能增强SCI模型中轴突再生，并减少神经胶质细胞的激活^[63]。NG2被认为是脊髓损伤后限制轴突生长的关键抑制因子之一。最近1项研究发现，腺相关病毒载体介导的NG2功能中和抗体和神经营养素-3可改善成年大鼠脊髓挫伤后的突触传递、运动以及尿路功能^[64]。通过调节CSPGs为神经再生构建1个有利的细胞外基质环境，是促进SCI后内源性修复的策略之一。

4 总结与展望

CSPGs在中枢神经系统的发育和稳态维持中发挥着重要作用，参与细胞黏附、神经细胞迁移、轴突引导以及维持突触稳定等过程。SCI后，损伤部位的多种细胞上调CSPGs的表达，包括星形胶质细胞、神经元、少突胶质细胞和巨噬细胞。CSPGs在SCI后内源性修复中起抑制作用，主要包括抑制轴突出芽和轴突传导，阻止少突胶质细胞的再髓鞘化和促进SCI后的炎症反应。然而，关于CSPGs使损伤脊髓再生能力降低的机制仍未完全阐明，例如CSPGs促进神经炎症的具体机制。因此，更深入地研究CSPGs在人体生理和疾病中的作用，有助于人们真正认识CSPGs在SCI后的内源性修复中所扮演的角色。

减轻CSPGs在神经修复中的抑制作用，是目前关于SCI治疗的研究方向之一。主要的治疗策略包括使用ChABC降解GAG链，减少SCI后CSPGs的合成和阻断与CSPGs抑制作用相关的受体，相关研究结果都显示出这些策略的有效性，但也存在疗效有限、操作复杂等问题。目前，一些研究使用新型的基于生物材料的递送系统和生物载体将抑制CSPGs的药物输送至SCI部位，有望提高疗效，促进SCI患者神经功能恢复。

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基金资助

国家自然科学基金资助项目(31960175)