基于肠道菌群探讨运动改善2型糖尿病小鼠骨髓内皮组细胞功能的影响研究

To investigate the effect of exercise on the function of bone marrow endothelial cells in type 2 diabetic mice based on intestinal flora

摘要

目的 探讨有氧联合抗阻运动是否通过改善肠道有益菌群的多样性、丰度、结构及其对2型糖尿病小鼠骨髓内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）功能的影响。 方法 将40只8周龄雄性db/db小鼠随机分为空白对照组（DZ组）糖尿病模型+有氧联合抗阻运动组（联合运动）（L组）、糖尿病模型+粪便移植组（SY组）、糖尿病模型组（TJ组），每组10只。L组进行8周有氧联合抗阻运动干预，于周一、周三和周五进行有氧运动，周二、周四和周六进行抗阻运动，6 d/周。SY组和TJ组分别采用L组运动8周后的小鼠粪便和DZ组小鼠粪便制成悬浊液予灌肠，2次/d，共14 d。灌肠结束后检测各组小鼠骨髓EPCs增殖、迁移、黏附和体外血管生成能力，采用流式细胞仪检测鉴定EPCs表型CD34和CD31，16SrRNA检测各组小鼠粪便肠道菌群的丰度及多样性ELISA检测各组小鼠血清胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide1，GLP-1）。 结果 肠道菌群多样性结果显示，在纲水平上，与TJ组比较，SY组小鼠肠道Clostridia（54.60% vs. 32.21%）和Bacteroidia（47.63% vs. 36.39%）的丰度上升，Gammaproteobacteria（0.30% vs. 12.57%）丰度下降，差异有统计学意义（P=0.019、P=0.028、P=0.002）与DZ组比较，SY组小鼠的肠道Bacteroidia（47.63% vs. 38.5%）丰度上升，Bacilli（2.56% vs. 12.36%）丰度下降，差异有统计学意义（P=0.021、P=0.039）。在科水平上，与DZ组比较，SY组小鼠肠道产丁酸盐细菌Lachnospiraceae（43.86% vs. 26.44%）和Oscillospiraceae（7.8% vs. 2.15%）的丰度显著升高（P=0.004、P=0.001）与TJ组比较，SY组小鼠肠道Lachnospiraceae（43.86% vs. 32.89%）、Lactobacillaceae（9.89% vs. 3.8%）和Oscillospiraceae（7.8% vs. 2.21%）菌群丰度显著升高（P=0.045、P=0.006、P=0.001）。SY组小鼠EPCs增殖、迁移、黏附和血管生成能力明显高于DZ组和TJ组（P=0.002、P=0.000、P=0.000、P=0.000、P=0.016、P=0.049、P=0.019、P=0.026）。DZ组SY组和TJ组3组小鼠血清GLP-1（pmmol/L）含量（1.90±0.22，2.82±0.40和2.24±0.49）比较，差异有统计学意义（F=31.082，P=0.000）。与DZ组比较，SY组小鼠血清GLP-1水平明显升高（P=0.000）与TJ组相比，SY组小鼠血清GLP-1水平显著升高（P=0.000）肠道菌群数量与内皮组细胞功能相关性分析结果显示：Clostridia（r=0.696，P=0.041）、Oscillospiraceae（r=0.697，P=0.037）Muribaculaceae与内皮组细胞迁移能力（r=0.753，P=0.019）和血管生成（r=0.810，P=0.008）呈正相关。 结论 有氧联合抗阻运动可能通过提高2型糖尿病小鼠肠道有益菌的丰度、多样性及结构及提高GLP-1表达，从而改善2型糖尿病小鼠骨髓EPCs功能。

Abstract

Objective To investigate whether aerobic exercise combined with resistance exercise can improve the diversity，abundance and structure of intestinal beneficial flora and its effect on the function of bone marrow endothelial progenitor cells（EPCs） in type 2 diabetic mice. Methods Forty 8-week-old male db/db mice were randomly divided into control group（DZ group）. Diabetic model + aerobic and resistance exercise group（combined exercise）（L group），diabetic model + fecal transplantation group（SY group），and diabetic model group（TJ group），with 10 rats in each group. Group L carried out aerobic exercise combined with resistance exercise for 8 weeks，aerobic exercise on Monday，Wednesday and Friday，and resistance exercise on Tuesday，Thursday and Saturday，6 days/W. In SY and TJ groups，the feces of mice in group L and DZ after 8 weeks of exercise were made into suspension，respectively，and then enema was given twice a day for 14 days. After the end of enema，the proliferation，migration，adhesion and angiogenesis ability of bone marrow EPCs in each group were detected. The EPCs phenotypes CD34 and CD31 were identified by flow cytometry，and the abundance and diversity of intestinal flora in feces were detected by 16SrRNA. ELISA was used to detect serum glucagon-like peptide1（GLP-1） in each group. Results At the class level，the abundance of Clostridia（54.60% vs. 32.21%） and Bacteroidia（47.63% vs. 36.39%） in the SY group was higher than that in the TJ group. The abundance of Gammaproteobacteria（0.30% vs. 12.57%） was significantly decreased（P=0.019，P=0.028，P=0.002）. Compared with DZ group，the abundance of Bacteroidia in SY group increased（47.63% vs. 38.5%），and the abundance of Bacilli decreased（2.56% vs. 12.36%），and the difference was statistically significant（P=0.021，P=0.039）. At the family level，the abundance of Lachnospiraceae（43.86% vs. 26.44%） and Oscillospiraceae（7.8% vs. 2.15%） in the SY group was significantly higher than that in DZ group（P=0.004，P=0.001）. Compared with the TJ group，The abundance of Lachnospiraceae（43.86% vs. 32.89%），Lactobacillaceae（9.89% vs. 3.8%） and Oscillospiraceae（7.8% vs. 2.21%） in the intestinal tract of SY group was significantly increased（P=0.045，P=0.006，P=0.001）. The proliferation，migration，adhesion and angiogenesis of EPCs in SY group were significantly higher than those in DZ group and TJ group（P=0.002，P=0.000，P=0.000，P=0.000，P=0.016，P=0.049，P=0.019，P=0.026）. The content of serum glucagon peptide-1（GLP-1）（pmmol/L） in DZ group SY and TJ group（1.90±0.22，2.82±0.40 and 2.24±0.49） was significantly different（F=31.082，P=0.000）. Compared with DZ group，the serum GLP-1 level in SY group was significantly increased（P=0.000）. Compared with TJ group，the serum GLP-1 level in SY group was significantly increased（P=0.000）. The correlation analysis between the number of intestinal flora and the function of endothelial cells showed that：Clostridia（r=0.696，P=0.041），Oscillospiraceae（r=0.697，P=0.037） Muribaculaceae was positively correlated with cell migration（r=0.753，P=0.019） and angiogenesis（r=0.810，P=0.008） in the endothelial group. Conclusion Aerobic exercise combined with resistance exercise may improve the function of EPCs in bone marrow of type 2 diabetic mice by increasing the abundance，diversity and structure of beneficial intestinal bacteria and increasing the expression of GLP-1.

Graphical abstract

关键词

糖尿病 / 运动 / 胰高血糖素样肽-1 / 内皮组细胞 / 肠道菌群 / 粪便移植

Key words

diabetes mellitus / Exercise / GLP-1 / Endothelial progenitor cells / Gut microbiota / Fecal transplantation

糖尿病的心血管并发症是糖尿病患者死亡的主要原因之一，据统计全世界每年因糖尿病及其并发症死亡的人数约有500万，占总死亡人数的8.2%^[1]。其发生机制与内皮损伤及功能异常导致血管新生障碍有关^[2]。内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）可增殖分化成内皮细胞，能有效发挥促血管新生的作用从而预防糖尿病血管病变^[3]。因此，如何提高机体在糖尿病高糖状态下EPCs能力对防治糖尿病心血管并发症有重要意义。

胰高血糖素样肽-1（glucagon-like peptide1，GLP-1）是近年来治疗2型糖尿病及其2型糖尿病血管并发症的研究热点。研究表明，2型糖尿病患者GLP-1水平升高在促进胰岛β细胞分泌、控制血糖、减轻血管炎症损伤及其促进EPCs增殖、迁移和修复血管损伤等功能发挥着重要的作用^[4]。因此，机体GLP-1与血管EPCs功能密切相关，通过提高机体GLP-1的水平来改善内皮组细胞增殖、迁移、黏附及其血管生成能力，是防治2型糖尿病血管并发症亟待解决的临床关键问题。运动是糖尿病管理的有效手段，不少国内外文献证实了运动可改善肠道菌群结构，提高与促进GLP-1分泌相关的肠道菌群的丰度，如Lachnospiraceae、Faecalibacterium和prausnitzii等短链脂肪酸（SCFAs）细菌群的丰度。^[5-6] 目前关于运动改善EPCs功能主要以有氧运动和抗阻运动为主，有氧联合抗阻运动（联合运动）对2型糖尿病小鼠EPCs功能的影响的相关研究较少，且具体通过何种途径尚不明确。本研究将联合运动8周后的小鼠粪便制成粪便悬浮液移植入小鼠肠道，干预结束后体外分离培养骨髓源EPCs，检测各组小鼠EPCs功能以及小鼠肠道菌群的丰度和血清GLP-1表达。探讨有氧联合抗阻运动是否通过改善肠道菌群丰度和多样性，促进GLP-1分泌进而改善 EPCs能力，为运动改善肠道菌群及预防糖尿病心血管并发症提供新思路。

1 资料与方法

1.1 研究对象及分组

研究对象为：40只雄性BKSdb/dbC57小鼠，8周龄（购买于南京君科生物工程有限公司，随机血糖大于300 mg/L）作为2型糖尿病小鼠模型。将40只雄性BKSdb/dbC57小鼠随机分为空白对照组（DZ组）、糖尿病模型+有氧联合抗阻运动组（联合运动）（L组）、糖尿病模型+粪便移植组（SY组）、糖尿病模型组（TJ组），每组10只。

1.2 实验方法

1.2.1 运动干预方法

3组小鼠均以繁殖饲料喂养，空白对照组期间不做任何干预。糖尿病模型+有氧联合抗阻运动组（L组）采取为期8周的联合有氧+抗阻运动干预（一周运动干预6 d，即有氧运动的时间为星期一、三和五抗阻运动为星期二、四和六）。有氧运动方式是小鼠在坡度为0度的小鼠跑台（北京东西仪器科技有限公司，型号：WDW－1型）进行有氧跑步运动^[7]，具体见表1。抗阻运动采用尾部负重爬自制梯（高1 m，坡度为85°）运动^[8]，具体见表2。

1.2.2 粪便移植干预方法

本课题组前期通过对T2DM小鼠进行有氧运动、抗阻运动和有氧联合抗阻运动干预8周后检测小鼠肠道菌群，结果显示有氧联合抗阻运动方式更有利于提高2型糖尿病小鼠肠道菌群有益菌的丰度和组成。基于前期基础，本课题组采用糖尿病模型+有氧联合抗阻运动组小鼠作为粪便采集组，只采集该组小鼠的粪便用于粪便移植。采用抗生素持续予糖尿病模型+粪便移植组（SY组）和糖尿病模型组（TJ组）小鼠灌胃4周。结束后，分别采用糖尿病模型+有氧联合抗阻运动组运动8周后的小鼠新鲜粪便和空白对照组小鼠粪便制成悬浊液予灌肠予SY组和TJ组灌肠，2次/d，共14 d。灌肠前3 h将db/db小鼠放入清洁网笼，轻揉小鼠下腹部及肛门刺激排便，收集新鲜粪便，称重按照粪便与生理盐水1∶5的比例将两者混合搅拌均匀，按照人类和小鼠每公斤体重的剂量换算系数为9.01计算。按20 mg/kg算0.3 g/d，予0.3 mL的500 mg/mL粪便悬浊液灌肠。

1.2.3 肠道菌群检测

应用16SrRNA高通量测序技术测定菌群。称取各组粪便样本各100 mg，釆用E.Z.N.A.StoolDNAKit提取样品的总基因组DNA，紫外分光光度计下测定DNA样品中核酸纯度。针对所有粪便细菌的16SrRNAV4区，合成带有barcode的特异引物，PCR反应体系扩增后，对目的条带使用胶回收试剂盒回收纯化产物。Quant iTPicoGreendsDNAAssayKit建库试剂盒对纯化产物进行文库的构建，再使用MiSeq平台进行上机测序。

1.2.4 物种注释及分类学分析

使用USEARCH^[9]（version 10.0）在相似性97%（默认）的水平上对序列进行聚类，默认以测序所有序列数的0.005%作为阈值过滤OTUs^[10]。根据Feature的序列组成得到其物种分类。对于肠道菌群多样性分析，利用Alpha多样性指数分析和Beta多样性分布分析展示，在相同物种丰富度的情况下，群落中各物种具有越大的均匀度，则认为群落具有越大的多样性，说明样品的物种多样性越高^[11]。

1.2.5 EPCs的分离培养与鉴定

干预结束后取材，各组均采用全骨髓贴壁法培养EPCs。用无菌医用剪刀、镊子分离小鼠肱骨、股骨及胫骨，存放于含抗生素（青霉素-链霉素-两性霉素B添加剂）的FBS的磷酸缓冲盐溶液（phophate-buffered saline，PBS）溶液中，紫外线消毒杀菌超净台30 min后转移标本，用含三抗的无菌PBS反复3~4次冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞至无菌50 mL离心管中，用1 200 r/min，离心5 min后用无菌巴氏吸管吸取出上层细胞冲洗液，加入PBS清洗细胞，离心获取细胞沉淀，加入EGM-2MV培养基EPCs，按10⁶/cm²的密度接种于预先用人纤维连接蛋白包被的25 cm正方透气盖斜口细胞培养瓶中，置于含有浓度为5%二氧化碳培养箱培养，其温度为37 ℃，饱和湿度为95%。每天在显微镜下观察细胞生长情况，于培养后第4 d予细胞第1次换液，并在显微镜下观察EPC形态及生长情况后加入含有生长因子和胎牛血清的培养基，置于培养箱中培养，之后每隔48 h换液。细胞生长增殖到一定数量后对EPCs进行流式鉴定，待细胞生长汇合度达到80%后对细胞传代培养。对EPCs进行，收集1×10⁶细胞，加入1 mL PBS重悬细胞，1 200 r/min离心5 min，弃上清。分别加入含CD31-PE（5 μL）、CD34-PE（5 μL）、的100 μL PBS（含1% BSA），4 ℃避光孵育20 min。用PBS（含1% BSA）重悬细胞，1 200 r/min离心5 min弃上清。加入400 μL PBS（含1% BSA）悬浮细胞，上机鉴定。

1.2.6 EPCs增殖功能

①收集DZ组、SY组和TJ组的细胞，调整细胞悬液浓度，使待测细胞调密度至1×10⁵个/mL，96孔板每孔加入100 μL。②5% CO₂，37 ℃分别培养细胞24 h、48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，细胞培养箱内继续孵育1 h，在450 nm测定吸光度。

1.2.7 EPCs迁移功能

采用细胞划痕实验检测细胞迁移功能。计数至1×10⁶个/mL各取1 mL细胞悬液加入至6孔板中，再加入1 mL完全培养基，5% CO₂，37 ℃培养细胞24 h取出，吸去原培养基，用20 μL枪头划痕（正中间竖线一道），PBS清洗2次后，在6孔板底部用黑色记号笔横线划分三等分，显微镜下分别拍照3~5处，并保存数据，加入无血清培养基，再将划痕后的6孔板置于5% CO₂，37 ℃培养细胞48 h，取出吸去原培养基，PBS清洗1次后显微镜下拍照并保存数据。各组EPCs分别于0 h和48 h在倒置荧光/相差显微镜成像分析，并计算其迁移率。

1.2.8 EPCs黏附功能

①人纤连蛋白在96孔板包被，包被浓度为5 μg/cm²，PBS稀释纤连蛋白原液，每孔加入50 μL稀释后的纤连蛋白，即置于5% CO₂，37 ℃细胞培养箱中包被，包被时间为2 h。②取DZ组、SY组和TJ组的细胞消化重悬计数，使各组细胞浓度为1×10⁵个/mL，弃去孔板中未结合的纤连蛋白，PBS清洗2次后接种细胞，每孔加入100 μL细胞悬液。③接种1 h后，吸去培养基，PBS缓缓洗涤细胞3次，显微镜下观察各组细胞贴壁情况，每组取9个视野进行拍照记录。

1.2.9 EPCs体外血管生成能力

①基质胶准备：实验前1 d将基质胶置于4 ℃冰箱过夜，使胶能缓慢融化（同时4 ℃预冷枪头用于吸取基质胶，同时预冷96孔板）。②待基质胶冻融后，用预冷枪头混匀，EP管提前预冷置于冰盒中，取出预冷的96孔板，每孔加入50 μL基质胶原液，加入时避免产生气泡，置于细胞培养箱中60 min待其凝固。③消化DZ组、SY组和TJ组的细胞，计数至3×10⁵个/mL，每孔加入100 μL细胞悬液，细胞培养箱培养4 h后显微镜下观察并拍照。

1.2.10 检测GLP-1水平

ELISA法检测小鼠血清GLP-1。于干预后采用腹膜内注射戊巴比妥钠麻醉小鼠后进行眼球静脉采血，收集的血液静置2 h离心分离血清，具体操作方法均按ELISA试剂盒说明书进行。

1.3 统计学方法

采用Image J软件对图片进行分析、SPSS 26.0统计软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法，相关性分析用Pearson法或Spearman法。检验水准α=0.05。

2 结　果

2.1　运动对2型糖尿病小鼠肠道菌群多样性的影响。

2.1 1　各组小鼠肠道菌群Alpha多样性分布

各组小鼠肠道菌群Alpha多样性指数结果以Chao1、Simpson、Shannon、PD_whole_tree和ACE指数来展示。粪便移植后，3组小鼠肠道菌群Chao1、Simpson、Shannon、PD_whole_tree和ACE指数差异均有统计学意义（F=8.103，P=0.006；F=5.110，P=0.025；F=8.375，P=0.005；F=4.716，P=0.031；F=8.179，P=0.006）。两两比较结果显示，与TJ组比较，SY组小鼠肠道菌群的Simpson升高，差异均有统计学意义（P=0.049）与DZ组比较，SY组小鼠肠道菌群的Chao1、Simpson、Shannon、PD_whole_tree和ACE指数升高，差异均有统计学意义（P=0.002、P=0.009、P=0.002、P=0.010、P=0.002）。与DZ组比较，TJ组小鼠肠道菌群的Chao1、Shannon和ACE指数升高，差异均有统计学意义（P=0.017、P=0.017、P=0.017）。见表3。

2.1 2　各组小鼠肠道菌群Beta多样性分布

非度量多维标定法^[12]（Non-MetricMulti-Dimensional Scaling，NMDS）基于Bray-Curtis距离来进行分析的非线性模型，以点的形式反映在二维平面上。其设计目的是克服线性模型（包括PCA、PCoA）的缺点，更好地反映生态学数据的非线性结构，当stress小于0.05时，则具有很好的代表性。本研究小鼠肠道菌群Beta多样性以NMDS表示。如图1显示，3组小鼠肠道菌群具有明显的差异（stress=0.047 0）。

2.2 联合运动对2型糖尿病小鼠肠道菌群结构的影响

2.2.1 各组小鼠肠道菌群在纲（class）水平上分布

粪便移植后，在纲水平上，DZ组糖尿病小鼠粪便优势菌分别是梭菌纲（Clostridia）（38.5%），拟杆菌纲（Bacteroidia）（35.67%）、杆菌纲（Bacilli）（12.36%）以及变形菌纲（Gammaproteobacteria）（3.8%）这4种优势菌约占93%~96%。TJ组小鼠肠道梭菌纲、拟杆菌纲、杆菌纲以及变形菌纲分别占32.21%、36.39%、11.05%和12.57%。3组小鼠肠道菌群在纲水平比较，Clostridia、Bacteroidia和Gammaproteobacteria丰度有统计学意义（F=3.971，P=0.047；F=4.421，P=0.036；F=8.816，P=0.005）。两两比较结果显示，与TJ组比较，SY组小鼠肠道Clostridia（54.60%）和Bacteroidia（47.63%）的比例上升（P=0.019、P=0.028），Gammaproteobacteria（0.30%）丰度下降，差异有统计学意义（P=0.002）与DZ组比较，SY组小鼠的肠道Bacteroidia（47.63%）丰度上升（P=0.021），Bacilli（2.56%）丰度下降，差异有统计学意义（P=0.039）与DZ组比较，TJ组小鼠肠道变形菌纲比例上升（P=0.014）。见图2和图3。

2.2 2　各组小鼠肠道菌群在科（family）水平上分布

干预结束后，本实验结果显示：在科（family）水平上，3组小鼠肠道菌群丰度在毛螺菌科（Lachnospiraceae）、乳杆菌科（Lactobacillaceae）和颤螺菌科（Oscillospiraceae）比较，差异有统计学意义（F=6.465，P=0.012；F=5.485，P=0.020；F=12.231，P=0.001）。DZ组小鼠肠道毛螺菌科、乳杆菌科和颤螺菌科的丰度分别为26.44%、5.69%和2.15%，TJ组小鼠肠道毛螺菌科、乳杆菌科和颤螺菌科的丰度分别为32.89%、3.80%和2.21%，两两比较结果显示，与DZ组比较，SY组小鼠肠道产丁酸盐细菌Lachnospiraceae（43.86%）和Oscillospiraceae（7.8%）的丰度升高，差异均有统计学意义（P=0.004、P=0.001）与TJ组比较，SY组小鼠肠道Lachnospiraceae（43.86%）、Lactobacillaceae（9.89%）和Oscillospiraceae（7.8%）菌群丰度升高，差异有统计学意义（P=0.045、P=0.006、P=0.001）DZ组和TJ组小鼠肠道Lachnospiraceae、Lactobacillaceae和Oscillospiraceae菌群丰度比较，差异无统计学意义（P=0.213、P=0.127，P=0.936）。见图4。

2.3 EPCs细胞形态学观察与鉴定

内皮组细胞在蛋白包被的培养瓶中培养，24 h开始贴壁，4 d贴壁基本完全，EPCs形态大多数呈圆形或椭圆形，少部分细胞呈长梭形7 d后，EPCs多呈圆形或梭形14 d后EPCs不断增殖以梭形细胞增多，可见“铺石路”状改变，见图5。取细胞进行流式细胞术鉴定EPCs细胞表面标记，流式细胞仪检测表型CD31和CD34检出率分别为95.2%、27.9%。见图6。

2.4 EPCs功能

2.4.1 增殖

本研究采用粪便移植干预后观察小鼠EPCs的增殖能力，结果显示，3组小鼠EPCs增殖能力差异有统计学意义（F=17.176，P=0.003）。两两比较结果显示，SY组小鼠EPCs的增殖能力明显比TJ组和DZ组增强（P=0.002、P=0.000）。DZ组与TJ组小鼠EPCs增殖能力差异无统计学意义（P=0.588）。见表4。

2.4 2　粘附

本实验结果显示，3组小鼠EPCs粘附能力差异有统计学意义（F=13.843，P=0.000）。两两比较结果显示，SY组小鼠EPCs的粘附细胞数量明显多于DZ组和TJ组（均P =0.000）。DZ组与TJ组小鼠EPCs粘附能力差异无统计学意义（P=0.540）。见图7和表4。

2.4 3　迁移功能

研究结果显示：3组小鼠EPCs迁移能力差异有统计学意义（F=5.934，P=0.038）。两两比较结果显示，SY组小鼠EPCs的迁移能力高于DZ组和TJ组，差异有统计学意义（P=0.016、P=0.049）。DZ组与TJ组小鼠EPCs迁移能力差异无统计学意义（P=0.429）。见图8和表4。

2.4 4　血管生成功能

3组小鼠EPCs迁移能力差异有统计学意义（F=6.339，P=0.033）。两两比较结果显示，SY组小鼠EPCs体外血管形成官腔结构明显高于DZ组和TJ组，差异有统计学意义（P=0.019、P=0.026）。DZ组与TJ组小鼠EPCs血管生成能力差异无统计学意义（P=0.806）。见图9和表 4。

2.5 联合运动对2型糖尿病小鼠血清GLP-1水平的影响。

粪便移植干预后，DZ组SY组和TJ组3组小鼠血清GLP-1（pmmol/L）含量（1.90±0.22，2.82±0.40和2.24±0.49）比较，差异有统计学意义（F=31.082，P=0.000）。两两比较结果显示，与DZ组比，SY组小鼠血清GLP-1水平显著升高，差异有统计学意义（P=0.000）与TJ组相比，SY组小鼠血清GLP-1水平升高，差异有统计学意义（P=0.000）TJ组与DZ组相比，差异无统计学意义（P=0.368）。见图10。

2.6 肠道菌群与内皮组细胞功能相关性分析。

采用小鼠骨髓内皮组细胞增殖、迁移、黏附和血管生成功能与相应的肠道菌群（Clostridia、Bacteroidia、Bacilli、GammaproteoBacteria、Lachnospiraceae、Muribaculaceae、Bacteroidaceae和Lactobacillaceae）的数量分别进行两因素相关性分析。结果显示，Clostridia（r=0.696，P=0.041）、Oscillospiraceae（r=0.697，P=0.037）Muribaculaceae与内皮组细胞迁移能力（r=0.753，P=0.019）和血管生成（r=0.810，P=0.008）呈正相关。见表5。

2.7 联合运动对小鼠摄食量的影响

实验期间小鼠未发生呕吐、腹泻、便秘、便血精神萎靡及死亡等不良情况，小鼠均可正常饮食饮水。每周同一时间测量小鼠24 h摄食量和粪便量，小鼠24摄食量结果显示，根据重复测量设计方差分析，数据满足球形检验（χ²=22.331，P=0.079），故选择球形检验结果，即分组效应、组别与时间的交互作用、时间效应对24 h摄食量的影响均有统计学差异（F_组别=14.401，P_组别=0.001；F_时间=332.039，P_时间=0.000；F_交互=9.989，P_交互=0.000）。组别简单效应检验结果显示，除了在第1周，组别的简单效应不明显（F=1.857，P=0.198，偏η²=0.236），在第2、3、4、5和6周，组别的简单效应均明显（F=8.240，P=0.006，偏η²=0.579；F=36.51，P=0.000，偏η²=0.859；F=18.794，P=0.000，偏η²=0.758；F=3.978，P=0.047，偏η²=0.399；F=6.000，P=0.016，偏η²=0.5）。时间简单效应分析结果显示：DZ组、SY组和TJ组在3种不同方式干预下，时间的简单效应均明显（F=67.622，P=0.000，偏η²=0.977；F=46.547，P=0.000，偏η²=0.967；F=52.591，P=0.000，偏η²=0.970）。组间各时间点两两比较结果显示，与DZ组比较，SY组小鼠24 h摄食量在第2、3、4和6周差异有统计学意义（P=0.002，P=0.000，P=0.000，P=0.006）。与TJ组比较，SY组小鼠24 h摄食量在第3、5和6周差异有统计学意义（P=0.037、P=0.017、P=0.033）。见表6。

2.8 联合运动对小鼠24 h粪便量的影响。

根据重复测量设计方差分析，数据满足球形检验（χ²=12.758，P=0.558），故选择球形检验结果，即分组效应、组别与时间的交互作用、时间效应对24 h摄食量的影响均有统计学差异（F_组别=10.441，P_组别=0.002；F_时间=74.201，P_时间=0.000；F_交互=3.104，P_交互=0.003）。组别简单效应检验结果显示，除了在第1周，组别的简单效应不明显（F=0.083，P=0.092，偏η²=0.014），在第2、3、4、5和6周，组别的简单效应均明显（F=6.964，P=0.010，偏η²=0.537；F=4.696，P=0.031，偏η²=0.439；F=5.014，P=0.026，偏η²=0.445；F=8.164，P=0.006，偏η²=0.576；F=4.419，P=0.036，偏η²=0.424）。时间简单效应分析结果显示：DZ组、SY组和TJ组在3种不同方式干预下，时间的简单效应均明显（F=21.147，P=0.000，偏η²=0.930；F=10.012，P=0.003，偏η²=0.862；F=26.233，P=0.000，偏η²=0.943）。组间各时间点两两比较结果显示，与DZ组比较，SY组小鼠24 h排便量在第2和3周差异有统计学意义（P=0.004、P=0.021）。与TJ组比较，SY组小鼠24 h摄食量在第5差异有统计学意义（P=0.003、P=0.012）。见表7。

3 讨　论

运动是改善2型糖尿病的“五驾马车”之一。有研究表明运动可提高有益菌的数量和丰度，降低有害菌的数量，从而促进宿主健康^[13-14]。前期研究结果亦表明有氧联合抗阻运动8周的小鼠肠道菌群多样性和有益菌群的组成丰度及小鼠骨髓内皮组细胞功能优于单一的有氧运动或抗阻运动^[15-16]。而EPCs的数量和功能与某些肠道菌群密切相关。Sommese L等^[17]使用细菌B.henselae喂养小鼠后，其循环EPCs数量下降，而使用细菌B.fragilis喂养小鼠后能拮抗细菌B.henselae引起的EPCs数量下降。补充益生菌LisosanG或乳酸菌能阻止脂多糖损害EPCs的活性和功能^[18-19]。但运动如何影响EPCs的功能的具体机制尚未明确。

为了探究有氧联合抗阻运动以何种方式影响2型糖尿病患者EPCs的功能，将有氧联合抗阻运动后小鼠的粪便移植入无菌小鼠后，对各组小鼠的骨髓EPCs的功能进行检测。本研究结果显示：运动提高了肠道菌群的多样性和结构，干预后，SY组小鼠肠道菌群的Chao1、Simpson、Shannon、PD_whole_tree和ACE指数高于DZ组，与Liu Y^[20]等研究一致。在纲（class）水平上，与TJ组比较，SY组小鼠的梭菌纲和拟杆菌纲的比例上升。变形菌纲比例下降与DZ组比较，SY组小鼠的肠道菌群拟杆菌纲比例上升与Friques AG等^[19]研究一致。在科（family）水平上，与DZ组比较，SY组小鼠产丁酸盐细菌毛螺菌科（Lachnospiraceae）和颤螺菌科（Oscillospiraceae）的肠道菌群丰度显著升高。与TJ组比较，SY组毛螺菌科（Lachnospiraceae）、乳杆菌科（Lactobacillaceae）和颤螺菌科（Oscillospiraceae）的肠道菌群丰度显著升高。与Yang WQ等^[21]研究一致。本研究还发现肠道菌群中有益菌与内皮组细胞功能具有显著相关性，内皮组细胞功能随着有益菌的丰度的升高而增强。提示有氧联合抗阻运动改善2型糖尿病EPCs功能的途径可能通过提高肠道菌群有益菌的丰度和结构及多样性增加循环中EPCs的数量，促进损伤血管的修复能力，预防2型糖尿病血管并发症的发生。

肠道菌群可能通过其代谢产物影响宿主健康，肠道菌群的代谢产物如短链脂肪酸、氧化三甲胺等则会加剧心血管疾病的发生发展。研究表明运动可通过提高梭状芽孢杆菌科、乳杆菌科等产丁酸盐类菌群的丰度产短链脂肪酸（short-chain fattyacids，SCFA）的有菌群产生^[22]，SCFA可刺激胰高血糖素样肽1（GLP-1），从而促胰岛素分泌、降低血糖以及改善胰岛素抵抗性^[23]，机体GLP-1水平增加可通过调节GLP-1受体依赖途径和非依赖途径促进 EPCs增殖与分化^[24-26]。Yin HG等^[27]研究报道，EPCs加入GLP-1干预后，EPCs的增殖、黏附和血管生成功能增强。本研究结果表明采用有氧联合抗阻运动组粪便移植后，SY组小鼠产SCFA的有益菌毛螺菌科、乳杆菌科和粪球菌科的丰度和数量高于DZ组和TJ组，GLP-1水平及EPCs增殖、迁移、黏附和体外血管生成功能亦高于其DZ组和TJ组。运动还可能通过降低氧化三甲胺（trimethylamine-N-oxide，TMAO）降低2型糖尿病心血管发生风险。1项对胰岛素抵抗的患者进行12周的运动干预研究发现，有氧运动组的患者血浆TMAO水平及颈动脉内膜内侧厚度明显减少，患心血管疾病风险随之降低^[28]，TMAO水平升高与动脉粥样硬化、血栓形成、心力衰竭等发病风险升高正相关^[29]。而与TMAO代谢相关的肠道菌群有梭状芽孢杆菌、埃希氏菌、肠杆菌、不动杆菌、变形杆菌^[30]。该研究发现运动粪便移植后，SY组小鼠杆菌纲及变形菌纲比例下降，小鼠体内TMAO水平可能下降，从而预防了血管损伤。此外，运动可减轻氧化应激损伤，氧化应激反应是糖尿病血管损伤的中心环节，肠道菌群在机体抗氧化系统中具有重要作用。研究显示，摄入益生菌可有效提高抗氧化水平，降低超氧阴离子和过氧化氢的活性^[31]。肠道菌群可以介导非酶途径，通过还原硝酸盐，增加一氧化氮的水平，促进内皮组细胞生长，减少内皮组细胞功能障碍及血管损伤。

综上所述，联合有氧-抗阻运动可能通过增加肠道菌群有益菌的数量、丰度及多样性及促进GLP-1分泌、降低TMAO水平及氧化应激反应，从而改善2型糖尿病小鼠内皮组细胞的功能，从而防治2型糖尿病心血管病变。本研究将以运动改善肠道菌群为靶点，为预防糖尿病及其血管并发症提供临床依据。有关有氧联合抗阻运动通过调节肠道菌群改善EPCs功能的具体机制有待深入研究。

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基金资助

国家自然科学基金资助项目(8216090327)

广西自然科学基金资助项目(2018GXNSFAA050091)